Каждая исследовательская лаборатория имеет свой собственный метод работы, а некоторые из них настолько стандартны, что им не уделяется особого внимания. Это, безусловно, относится к агарозным гелям.
Агарозные гели — это многофункциональный инструмент в биологической лаборатории; вы используете их для проверки плазмидных препаратов перед выделением ДНК, результатов ПЦР, новых клонов… Существует так много способов применения агарозных гелей, что вы часто не задумываетесь о том, как их лучше всего использовать.
Но когда изображение геля выглядит некрасиво, Вы пожалеете, что не уделили лишние пять минут перед началом работы и не обдумали все более тщательно.
Был там, сделал это. Вот несколько отправных моментов для размышлений (желательно перед началом, но также и в том случае, если вы получили ужасные фотографии геля и не можете понять, почему), чтобы каждый раз получать гели с идеальной картинкой.
Советы по устранению неполадок с агарозными гелями
TBE или не TBE: Выбор правильного буфера
Наиболее популярными буферами являются TAE (Tris-Acetate-EDTA) и TBE (Tris-Borate-EDTA). Буфер нужен как для подготовки геля, так и для заполнения камеры, в которой он будет работать.
В целом, лаборатории, как правило, предпочитают один, но хорошо знать различия, чтобы вы могли сделать правильный выбор для вашего конкретного эксперимента. Несколько моментов, которые следует учитывать при выборе буфера, включают в себя:
- TAE лучше всего подходит для больших фрагментов ДНК, в то время как TBE лучше всего работает для меньших фрагментов ДНК, так как обеспечивает большее разрешение.
- TBE имеет большую буферную емкость и рекомендуется для более длительных прогонов геля; однако борат в TBE является ферментативным ингибитором, поэтому, если вы планируете использовать ДНК для любого последующего TAE приложения является правильным выбором.
- Запасы TAE со временем становятся более стабильными, в то время как запасы TBE могут выпасть в осадок через несколько недель (совет: я обычно использую туберкулез для анализа, поэтому я должен подготовить небольшое количество 5X запасов, чтобы избежать выпадения осадков).
Убедитесь, что вы учитываете эти различия при выборе лучшего буфера для анализа.
Держите его свежим.
После того, как вы решили, какой буфер будет работать лучше всего для вашего эксперимента, вы должны ВСЕГДА иметь свежий буфер, чтобы подготовить ваш гель и запустить его.
Под свежим я подразумеваю свежеразбавленный буфер, который раньше не использовался. Хранить запас в 5X или 10X концентрации (или выше в случае TAE) — это нормально, но обязательно разбавите его прямо перед использованием.
Не используйте буфер из предыдущих запусков — время, которое вы сэкономите от того, чтобы не делать свежий буфер, будет ничтожно малым по сравнению с тем, чтобы снова запустить весь эксперимент для получения пригодной для использования картинки.
Не спешите
Это самый важный совет: не торопитесь с агарозным гелем! Вы же не хотите, чтобы ваш прекрасный результат клонирования был испорчен ужасной картиной только потому, что вы торопились.
Вы должны запустить гель при напряжении ниже 75 В и убедиться, что буфер не перегревается. Вы можете уменьшить риск перегрева, охладив буфер и/или гель перед запуском, или запустить электрофорез в холодильной камере.
Будьте осторожны с большими гелями: они могут нагреваться в центре, пока края остывают. Одной из основных причин размазывания неровных полос является температура буфера. Вы можете (и должны) избежать этого, поддерживая постоянное напряжение в пределах от 50 до 75В.
Вопросы презентации
Помните, что ваш результат будет таким же хорошим, как и то, как вы его представляете. Нет способа убедить вашего босса, что плохой рисунок будет достаточным только потому, что фрагмент «есть». Не тратьте время впустую, чтобы получить данные, поторопившись с шагом прогона геля!
Добавить комментарий