Простой и надежный протокол извлечения ядер

Выделение ядер позволяет разделить ядерные и цитоплазматические клеточные компоненты и связанные с ними образцы. Коммерческие наборы упрощают процесс, но редко объясняют, что делают химические вещества, что затрудняет поиск и устранение проблем в случае сбоя. Понимание того, как работает экстракция ядер, может помочь вам получить лучшие результаты, позволяя устранять неполадки.

Приходилось ли вам покупать готовый набор и следовать инструкциям только для того, чтобы понять, что вы не уверены, почему вы делаете определенные шаги именно так, как предписано? Бывало ли так, что процесс шел неправильно, и вы жалели, что не знаете, что делает каждый реагент?

Неудивительно, что многие из этих наборов не содержат информации о составе реагентов и не объясняют их назначение.

В результате мы обычно следуем инструкциям набора, не зная, зачем выполняются те или иные шаги, а это не лучший способ заниматься наукой. Здесь представлен надежный и аннотированный протокол ядерной экстракции, который расскажет вам, что делают реагенты, какие шаги нужно выполнять и почему. Кроме того, будут даны несколько советов по увеличению выхода ваших экстрактов!

Что такое ядерная экстракция?

Ядерная экстракция — это процесс разделения ядерной и цитоплазматической фракций клетки. Это альтернатива протоколам лизиса целых клеток, например, с использованием буферов для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA).

При лизисе целых клеток вся клетка просто взрывается, в результате чего образуется смесь цитоплазмы и ядер, что означает, что в итоге мы получаем множество ненужных клеточных частиц, плавающих в клетке. Ядерная экстракция полезна при изучении молекул, специфически взаимодействующих с ядром, например, факторов транскрипции, связывающих ДНК.

Простой 6-шаговый протокол для экстракции ядер

Перед началом работы вам необходимо подготовить буферы для цитоплазматической и ядерной экстракции в соответствии с рецептами, приведенными в таблицах 1 и 2 ниже. Затем выполните следующие шаги и постоянно держите образцы на льду.

  1. Соберите клетки путем трипсинизации или соскабливания. Затем промойте их фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). Делайте это так, как вы обычно собираете клетки для лизиса целых клеток. На этом этапе включите ингибиторы протеазы и фосфатазы.
  2. Суспендируйте гранулы клеток в 500 мкл буфера для выделения цитоплазмы. Он гипотоничен и разрушает клеточную стенку, но сохраняет ядерную мембрану неповрежденной.
  3. Добавьте детергент, например, 0,05% NP40, и перемешайте вортекстом, чтобы отделить ядра от цитоплазматической фракции. SDS не рекомендуется, так как он денатурирует, поэтому выделенные белки не будут находиться в своей нативной форме.
  4. Центрифугируйте раствор и соберите супернатант. Он должен содержать цитоплазму.
  5. Ресуспендируйте гранулу (которая содержит ядра) в 400 мкл буфера для экстракции ядер и перемешивайте вортексом каждые несколько минут в течение 30 минут. Это разрушит ядерную мембрану. Обратите внимание, что на этом этапе можно добавить глицерин, чтобы сохранить структуру и функцию образцов при замораживании для будущих экспериментов, таких как анализ электрофоретического сдвига подвижности.
  6. Центрифугируйте при ~25 000g при 4°C в течение ~15 минут и соберите супернатант (содержащий ядерную фракцию). В конечной грануле должны быть только остатки клеточных мембран. Выбросьте ее, когда убедитесь, что она вам не нужна.

Буфер для экстракции цитоплазмы
Таблица 1. Рецепт буфера для экстракции цитоплазмы с пояснениями, что делают химические вещества.

Реагент
Концентрация

Назначение

HEPES, pH 7.9

10 мМ

Буфер. Поддерживает стабильный уровень pH.

Хлорид магния

1.5 мМ

Соль. Низкая концентрация способствует лизису клеток (гипотоническая), но достаточна для поддержания солюбилизации полярных видов за счет увеличения ионной силы раствора.

Хлорид калия

 

10 мМ

Соль. Назначение как выше. Концентрация KCl может быть увеличена до 60 мМ, а хлорид магния опущен.

DTT

0.5 мМ

Восстанавливающий агент. Предотвращает повреждающее окисление.

EDTA

1.0 мМ

Хелатирующий агент. Защищает образцы от разрушения путем хелатирования двухвалентных катионов.

NP40

0.05%

Детергент. Помогает лизировать клетки и солюбилизирует мембранные фракции и липиды.

Буфер для экстракции ядер
Таблица 2. Рецепт буфера для ядерной экстракции с пояснениями, что делают химические вещества.

Реагент

 

Концентрация

 

Назначение

 

HEPES, pH 7.9

5 мМ

Буфер. Поддерживает стабильный pH. Заменяет трис.

Хлорид магния

1.5 мМ

Соль. Помогает удерживать полярные виды в растворенном состоянии, повышая ионную силу раствора.

Хлорид натрия

300 мМ

Соль. Высокая концентрация помогает сбалансировать отрицательный заряд на фосфатных группах ДНК. Также увеличивает ионную силу раствора.

DTT

0.5 мМ

Восстанавливающий агент. Предотвращает повреждающее окисление.

EDTA

0.2 мМ

Хелатирующий агент. Защищает ДНК от разрушения путем хелатирования двухвалентных катионов.

Глицерол

26%

Антифриз. Нарушает сеть водородных связей в воде, чтобы остановить ее замерзание и превращение в лед.

Советы по улучшению экстракции

Даже самые лучшие протоколы могут нуждаться в модификации для сложных случаев. Вот несколько советов, которые помогут вам оптимизировать извлечение ядер.

1. Экспериментируйте со сдвигом для усиления лизиса
На этапах, разрушающих мембраны (№ 2 и № 5), вы перемешиваете образец вихрем, чтобы облегчить лизис. Однако иногда вихревого перемешивания недостаточно. Может помочь использование тонкой иглы 25-го калибра для сдвига клеточного материала.

2. Вортексируйте и инкубируйте дольше, чтобы помочь лизису ядра
На этапе выделения ядер (№ 5) ядро может быть трудно лизировать. Во многих протоколах рекомендуется перемешивать ядро вихрем каждые несколько минут в течение 30 минут — часа. По моему опыту, увеличение времени вихревого перемешивания и инкубации приводит к более высоким выходам.

3. Экспериментируйте с объемами ресуспензии
Не всегда придерживайтесь объемов реагентов, рекомендованных наборами.

Уменьшение объема буфера для экстракции ядер увеличит концентрацию ядерного белка. Это необходимо, если вы хотите получить ядерный и цитоплазматический экстракты сопоставимой концентрации, поскольку общий ядерный белок почти всегда меньше цитоплазматического.

4. Собирайте образцы по ходу работы
Каким бы опытным мы ни были, время от времени что-то идет не так. Собирайте примерно 10 мкл образца на каждом этапе, даже если вы не собираетесь его использовать или не подозреваете, что он содержит что-то ценное. И сохраните все до поры до времени.

Проанализируйте эти образцы с помощью подходящего анализа, например, анализа Брэдфорда или любого другого метода, который обнаруживает ваш образец. Это позволит вам проследить, как ваш образец проходит процесс экстракции. Только после того, как вы убедитесь, что ваш образец присутствует в той фракции, в которой вы ожидаете его увидеть, отбрасывайте ненужный материал!

Как проверить результаты
После того как вы провели экстракцию ядер, как узнать, что вы действительно получили ядра в ядерной фракции и цитоплазму в цитоплазматической фракции?

Вы можете определить чистоту ваших экстрактов, сделав вестерн-блот на специфические маркеры, которые, как мы знаем, находятся в каждом типе образца (ядро, цитоплазма, мембрана и т.д.).

Общие маркеры, специфичные для ядерных образцов, включают:

гистоны — молекулы, вокруг которых оборачивается ДНК.
ТАТА-связывающий белок — белок, который связывается с ТАТА-боксами на ДНК.
Общие цитоплазматические специфические маркеры включают:

белки теплового шока — они обычно находятся в митохондриях, а не в ядре.
Виментин — компонент цитоскелета.

Что мы узнали о ядерной экстракции

Теперь у вас есть простой протокол извлечения ядер, к которому вы можете возвращаться. Почему бы не добавить эту страницу в закладки для удобства поиска?

Мы надеемся, что описание того, что делает каждый химикат, прояснило некоторые загадки, связанные с коммерческими наборами, на которые мы полагаемся.

Кроме того, советы по устранению неполадок и оптимизации должны направить ваши действия на правильный путь, когда что-то идет не так, и позволить вам получить максимальный урожай.

Есть ли у вас собственные советы, которые вы хотели бы добавить? Может быть, мы упустили какую-то важную деталь протокола? Сообщите нам об этом в разделе комментариев ниже, и мы добавим ваши предложения в статью.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.