Люциферазный репортерный анализ широко используется в качестве инструмента для изучения экспрессии генов на транскрипционном уровне. Он широко используется, поскольку удобен, относительно недорог и позволяет мгновенно получать количественные измерения.
Он находит широкое применение в различных областях клеточной и молекулярной биологии — везде, где требуется измерить или отследить экспрессию клонированного гена.
Как и в случае со многими другими анализами и наборами, многие люди, использующие люциферазный репортерный анализ, не тратят время на то, чтобы полностью понять, как он работает. Но понимание основ используемых вами методик необходимо для устранения неполадок, когда вы столкнулись с проблемой, и для того, чтобы убедить экзаменаторов вашей диссертации в том, что вы знаете, о чем говорите!
Поэтому давайте погрузимся во внутреннюю работу люциферазного анализа.
Реакция, лежащая в основе люциферазного репортерного анализа
Люциферазы относятся к классу окислительных ферментов, встречающихся у нескольких видов, которые позволяют организмам, экспрессирующим их, «биолюминесцировать», или излучать свет. Самый известный из этих ферментов — люцифераза светлячков. Светлячки способны излучать свет в результате химической реакции, в которой люциферин превращается в оксилюциферин под действием фермента люциферазы. Часть энергии, выделяемой при этой реакции, находится в форме света.
Эта реакция очень энергетически эффективна, то есть почти вся энергия, вложенная в реакцию, быстро преобразуется в свет. Это делает ее чрезвычайно чувствительной, что отлично подходит для репортерного анализа!
Интересное замечание… Биолюминесценция служит множеству различных целей в природе. Некоторые из них включают в себя коммуникацию, поиск партнера для спаривания, поиск пищи, камуфляж и самооборону. Считается, что у насекомых она играет дополнительную роль в детоксикации кислорода — функция, которая, предположительно, развилась совсем недавно. Но я отвлекся… вернемся к анализу…
Проведение анализа
Существует несколько коммерчески доступных наборов для репортерного анализа люциферазы, включающих экспрессионные векторы, содержащие репортерный ген люциферазы (или его разновидность) и реагенты, необходимые для проведения реакции.
Для проведения репортерного анализа вы клонируете регуляторную область интересующего вас гена (X) перед геном люциферазы в одном из этих экспрессионных векторов, вводите полученную векторную ДНК в клетки и позволяете клеткам расти в течение определенного периода времени, чтобы произошла транскрипция и трансляция.
Затем вы собираете клетки, вскрываете их, чтобы высвободить все белки (включая люциферазу), добавляете люциферин и все необходимые кофакторы и измеряете ферментативную активность с помощью люминометра (прибора, который измеряет световое излучение образцов и выдает количественное показание).
Поскольку X контролирует экспрессию репортерного гена люциферазы, активность люциферазы можно напрямую соотнести с активностью X.
Какую информацию сообщает вам люциферазный анализ?
Люциферазный репортерный анализ позволяет изучить регуляторный контроль интересующего вас гена. Присутствие света означает, что люцифераза транскрибировалась, и, следовательно, регуляторная область была активна. Это может позволить вам определить, участвует ли конкретный белок в экспрессии интересующего вас гена или активна ли регуляторная область интересующего вас гена при определенных условиях.
Недостатки использования люциферазы в качестве репортера
Хотя репортерный анализ на люциферазе имеет ряд больших преимуществ, он также имеет некоторые недостатки:
Клетки обычно необходимо лизировать, прежде чем транскрипция может быть определена количественно (хотя существуют некоторые способы измерения активности люциферазы в живых клетках).
Люциферазе требуется АТФ для преобразования субстрата. Это означает, что метаболическое состояние клетки может повлиять на результат и внести погрешность в результаты. Однако это можно преодолеть, используя АТФ-независимые люциферазы.
Негерметичные промоторы иногда могут приводить к увеличению фонового сигнала, но для решения этой проблемы были созданы нестабильные репортеры, которые быстро разрушаются.
Преимущества использования люциферазы для изучения экспрессии генов
Этот репортерный анализ можно использовать для изучения экспрессии генов, а также других клеточных компонентов и событий, участвующих в регуляции генов.
Его чрезвычайная чувствительность позволяет количественно оценить даже небольшие изменения в транскрипции, а доступность результатов в течение нескольких минут после завершения эксперимента делает его еще более привлекательным.
По сравнению с флуоресцентными репортерами, люцифераза имеет низкий фоновый сигнал.
В целом, репортерный анализ люциферазы может быть именно тем, что вам нужно, чтобы пролить свет на ваш проект!
Добавить комментарий