Оптическая ловушка представляет собой плотно сфокусированный лазерный луч с объективом с высокой числовой апертурой. Ее принцип относительно прост для объяснения, но очень мощный: любая диэлектрическая частица, освещенная высоко сфокусированным лазерным лучом, может попасть в область высокой интенсивности его фокальной плоскости. Эти частицы при попадании света перестраивают свой электрический заряд, создавая взаимодействие с самим светом, которое увлекает их туда, где интенсивность лазерного света самая высокая, т.е. в точку его фокусировки.
Там они остаются «в ловушке» до тех пор, пока другая сила, превышающая силу, удерживающую их на месте, не освободит их, или пока лазер не будет выключен.
Влияние сфокусированного лазерного света на маленькие объекты является невероятно важным принципом и достижением, которое присудило его первооткрывателю Алану Ашкину (Alan Ashkin) Нобелевскую премию по физике в 2018 году. Было показано, что оптические ловушки работают в диапазоне размеров частиц от десятков микрон до сотен ангстремов, а также позволяет удерживать отдельные атомы.
Метод оптической ловушки позволил разработать новое поколение техники, известную как оптические пинцеты. Действительно, после самого первого эксперимента по доказательству принципа с использованием микрочипов удалось манипулировать вирусами и бактериями, а также одиночными клетками и внутриклеточными органеллами. Сегодня лазер и инструментарий оптических ловушек могут быть реализованы в различных микроскопических установках и демонстрируют, насколько легко эта методика может быть совмещена с различными визуальными подходами для достижения одновременной манипуляции и визуализации внутриклеточных свойств и динамики.
Лазерный луч
Лазер, используемый для захвата небольших объектов и клеток в экспериментах с биологическими образцами, как правило, является инфракрасным (ИК), так как более длинные волны могут использоваться свободно, не повреждая биологические образцы. Этот лазер может быть выровнен по световому пути практически любого коммерческого или изготовленного на заказ инвертированного оптического микроскопа.
Это выравнивание является наиболее сложной и технически сложной частью настройки оптических пинцетов, потому что качество ловушки и возможность ловить объекты зависит от идеального выравнивания лазерного света в объекте микроскопа, что приводит к лазерной фокусировки в центре плоскости образца микроскопа.
После правильного выравнивания необходимо переместить его фокус вблизи интересующего объекта, и он легко попадает в ловушку: этот объект, если он находится в подвешенном состоянии, может быть перемещен в трех измерениях.
Объекты в ловушке
В то время как все частицы, отвечающие определенным критериям (форма, размер, заряд), могут быть пойманы в ловушку оптическим пинцетом, наиболее часто используемыми частицами в биологических и биофизических экспериментах являются микробусы. Эти коммерчески доступные бусины могут быть изготовлены из диоксида кремния или полистирола и имеют размеры от 0,5 до 10 мкм. Они используются в качестве зонда для измерения биофизических свойств клеток, а также сил, прилагаемых одиночными клетками.
Поверхности бусин также могут быть покрыты высокореактивными химическими остатками (аминная или карбоксильная группа), которые могут быть соединены с пептидами или молекулами, представляющими интерес с точки зрения химической стимуляции клеток и клеточных отсеков.
Бусины — не единственное, чем можно манипулировать: липидные везикулы с размерами, сравнимыми с размерами микробусин, могут быть захвачены и свободно перемещаться в камере с образцом. Эти везикулы могут быть заполнены множеством молекул и позволяют стимулировать очень специфическую субклеточную область с высокой пространственной и временной точностью.
Кроме того, биологические образцы, такие как вирусы, клетки и субклеточные органеллы, могут быть непосредственно пойманы в ловушку для исследования их биофизических свойств в различных средах, а также их изменения в различных условиях.
Делайте или не делайте. Попробовать не получится.
Экспериментальный план биофизического эксперимента с использованием оптического пинцета сильно зависит от подготовки образца и от типа исследования, которое предполагается провести. Образцы могут быть приготовлены так же, как и для любого другого эксперимента с живым изображением, с использованием либо стеклянной чашки Петри, либо стеклянных крышек, которые помещаются в камеры визуализации. Микрочипы затем, как правило, пипетуются непосредственно над клетками, представляющими интерес, в ловушку по одному с оптическим пинцетом, и перемещаются в непосредственной близости от исследуемых клеток.
Физические характеристики ловушки могут быть откалиброваны: оптическая ловушка, как было сказано ранее, зависит от силы, которая удерживает объект, попавший в ловушку в фокальной точке лазера. Эта сила может быть количественно определена и использована в качестве эталона для измерения биофизических характеристик клеток. Затем захваченная бусина используется для проталкивания интересующей клетки, а вдавливание в клеточную мембрану по отношению к приложенной силе, рассчитанной с помощью калибровки ловушки, дает меру жесткости и упругости клеточной мембраны.
Кроме того, чтобы проткнуть клетки, можно просто подождать, пока клетки проткнут ловушку обратно. Вариация на одном и том же эксперименте может быть использована для количественной оценки силы, прилагаемой клеточными проекциями, такими как нейронные филоподии и ламелиподии, к бусинам с помощью сложных формул и расчетов.
Готов, Целься, Огонь!
В качестве интересного примера, вышеупомянутые липидные везикулы могут быть захвачены и перемещены вблизи клеточных компартментов, а затем разбиты для высвобождения их содержимого (любой молекулы или пептида), чтобы с высокой точностью стимулировать интересующие клетки.
Эта техника, однако, более сложна, чем обычные оптические пинцет, потому что она требует выравнивания другого лазера, кроме ИК-лазера, в том же пути света микроскопа: это ультрафиолетовый (УФ) лазер, используемый для доставки коротких импульсов высокой интенсивности и разрушения везикулы в ловушке, для освобождения ее содержимого.
Этот вариант действительно полезен, особенно в неврологии, так как нейронные клетки сильно фрагментированы и, особенно на первых стадиях развития и роста, склонны получать наводящие сигналы от близлежащих клеток, а также от своей мишени, расположенной на расстоянии нескольких сантиметров, а в некоторых случаях даже метров вдали. Это, конечно, не может уничтожить планеты, но с моей личной точки зрения, вполне удовлетворительно сломать эти маленькие везикулы и увидеть, как нейроны ползут в сторону или в сторону от того места, где находилась частица.
Световая сторона Силы
Помимо вышеизложенного о том, для чего могут использоваться оптические пинцеты, они также находят применение в измерении кровотока, изучении сил между отдельными молекулами, взаимодействия ДНК и белка, функционирования и сил молекулярных моторов, таких как миозин или динеины, и это лишь некоторые из них. И кого не удивляет самая маленькая игра в Тетрис?
В заключение, оптический пинцет — это очень мощный метод, который предлагает новый и творческий способ ответить на многие биологические вопросы, а его универсальность при применении к многочисленным микроскопическим установкам еще раз доказывает, что физика и биология более взаимосвязаны, чем можно подумать.
Добавить комментарий