Комплексы белок-ДНК представляют собой молекулярный интерфейс между стимулом и ответом для всех организмов, и трехмерные структуры этих комплексов важны во многих областях исследований, включая открытие лекарств и эпигенетику.
Большинство структур комплекса белок-ДНК решается с помощью кристаллографии белков, которая включает кристаллизацию комплексов белок-ДНК. Этот метод предоставляет подробную структурную информацию о макромолекулах с 1958 года. Тем не менее, кристаллизация белка остается процессом проб и ошибок, хотя сейчас это облегчается сложной робототехникой и поддерживается множеством успешных случаев.
Для некоторых из нас кристаллизация белковых комплексов ДНК для выяснения их структуры является центральной частью исследований. Вот некоторые ключевые параметры, которые необходимо оптимизировать, чтобы дать вам максимальный шанс на успех. Считайте эту статью рекомендацией к кристаллизации комплекса белок-ДНК.
Как определить последовательность ДНК, с которой связывается целевой белок
Вы не можете кристаллизовать комплекс белок-ДНК без ДНК. Если вам повезет, последовательность нуклеиновой кислоты, с которой связывается ваш целевой белок, доступна в литературе. Если это не так, вам нужно будет ее определить. Здесь есть два подхода
Биоинформатический подход
Несколько биоинформатических инструментов позволяют вам искать вероятные связывающие белок последовательности в геномах-мишенях, включая TransFac и CiiiDER. Для работы этим инструментам требуется такая информация, как ожидаемая укладка вашего ДНК-связывающего белка (спираль-поворот-спираль или цинковый палец и т. Д.) и его первичная последовательность.
Экспериментальный подход
Хотите поэкспериментировать? Вы можете экспериментально определить последовательность ДНК, с которой связывается ваш белок. Используемые методы в совокупности называются отпечатками ДНК, и есть много способов подойти к ним.
После того, как вы получили последовательность-кандидат, вам необходимо отжечь ее с комплементарной цепью, чтобы сформировать двухцепочечную молекулу ДНК, и проверить, связывается ли она с вашим белком, используя подходящий анализ. Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSAs) или изотермическая калориметрия титрования (ITC) являются двумя наиболее распространенными вариантами.
Больше не всегда лучше: обрезать ДНК
После того, как вы получили молекулу ДНК, с которой связывается ваш целевой белок, полезно определить ее самую короткую из возможных версий, которая все еще будет связываться с вашим целевым белком. Почему? Потому что, если вы хотите что-то кристаллизовать, полезно иметь образец этого чего-то с наименьшей энтропией .
Строго говоря, ненужные нуклеотиды добавляют энтропию к целевой молекуле, покачиваясь в растворе.
Согласно принципу свободной энергии Гиббса , потеря энтропии во время физико-химического процесса, такого как кристаллизация, снижает его спонтанность, делая его менее вероятным. Кроме того, удалив ненужные нуклеотиды, у вас будет меньше атомов для моделирования в ваших картах электронной плотности, что сэкономит ваше время .
Усечение ДНК — наиболее эффективный способ определения самой короткой «связываемой» последовательности ДНК, с которой связывается ваш целевой белок. Просто удалите пару оснований с одной стороны молекулы и одновременно добавьте пару оснований с другой стороны (здесь ничего особенного, просто каждый раз покупайте новые олигонуклеотиды). Затем выполните выбранный вами анализ связывания ДНК, чтобы проверить связывание, и продолжайте повторять процесс, пока не заметите, что молекула ДНК больше не связывается с вашим целевым белком.
Повторите весь эксперимент, но на этот раз добавьте пары оснований со стороны, с которой вы их удаляли, и удалите пары оснований со стороны, с которой вы их добавляли. Самая короткая связываемая последовательность ДНК будет заключена в двух случаях, когда целевой белок не может связываться с ДНК.
Создайте кристалл
Добавление непарных комплементарных нуклеотидов к 5′-концу каждого из двух одноцепочечных олигонуклеотидов в вашей молекуле ДНК — проверенный способ стимулирования кристаллизации комплекса белок-ДНК. Добавляя (скажем) нуклеотид аденина к одному 5′-концу и нуклеотид тимина к другому, вы можете способствовать образованию кристаллической решетки за счет спаривания оснований между выступающими нуклеотидами. Это может происходить посредством спаривания оснований Уотсона – Крика или чего-то более экзотического, например спаривания оснований Хугстина .
Используя стратегию «липких концов», можно получить кристаллы, в которых спаривание оснований Хугстина между выступающими нуклеотидами на соседних молекулах ДНК было решающим для кристаллизации. В отсутствие нависающих нуклеотидов образец со временем превратится в аморфный талькоподобный осадок. Поэтому обязательно включите эту стратегию в свой подход.
Оптимизируйте соотношение белка к ДНК
Здесь есть три основных подхода, каждый из которых имеет свои преимущества.
Подход смешивания и молитвы
Это универсальное решение для тех, кто плохо переносит длительные процедуры. Просто смешайте целевой белок с избытком ДНК, с которой он связывается (скажем, соотношение белок: ДНК 1: 2), подождите полчаса, чтобы они связались, а затем приступайте к экспериментам по кристаллизации. Если кристаллы все же образуются, вы можете оптимизировать это соотношение, чтобы посмотреть, можно ли увеличить их размер.
Обратной стороной этого подхода является то, что избыток ДНК снижает однородность образца кристаллизации, что может быть критическим фактором для успешной кристаллизации.
Стехиометрический подход
Это метод выбора ярких сторонников максимально однородной выборки. Смешайте целевой белок с избытком ДНК, с которой он связывается, выполните эксклюзионную хроматографию, чтобы выделить стехиометрический комплекс белок-ДНК 1: 1, а затем используйте этот образец в своих экспериментах по кристаллизации.
Обратной стороной этого подхода является то, что он добавляет дополнительную стадию эксклюзионной хроматографии и стадию центробежного концентрирования.
Эмпирический подход
Если вам известна константа диссоциации ( K D ) для вашего комплекса белок-ДНК, то вы можете рассчитать количество ДНК, необходимое для насыщения известной концентрации целевого белка.
Обратной стороной этого подхода является то, что, по всей вероятности, в вашем значении концентрации белка будет некоторая ошибка. Это приведет к ошибкам в ваших расчетах, а это означает, что вы в какой-то степени либо недостаточно, либо перенасыщаете свой белок.
Какой бы метод вы ни выбрали, ошибитесь в сторону перенасыщения целевого белка, поскольку избыток ДНК обычно будет менее вредным для ваших экспериментов по кристаллизации, чем две дискретные формы вашего целевого белка (несвязанная и ДНК-связанная).
Начать эксперименты по кристаллизации в слабокислых условиях
Комплексы белок-ДНК имеют тенденцию кристаллизоваться при нейтральном или умеренно кислом pH. Причиной этого служит то, что слабокислые растворы способствуют полярным контактам между отрицательно заряженным фосфатным остовом ДНК и положительно заряженными ДНК-связывающими остатками на вашем целевом белке. Лучше перестраховаться и пойти с большинством.
Существуют коммерческие сита для кристаллизации, разработанные специально для кристаллизации комплексов белок-ДНК. Например, Nucleix Screen от NeXtal Biotech, или Protein-Nucleic Acid Complex Crystal Screen от Kerafast.
Уход за кристаллами
После того, как вы вырастили кристаллы целевого комплекса белок-ДНК, держите их гидратированными и храните при температуре, при которой они росли. Кристаллы комплекса белок-ДНК обычно имеют содержание растворителя ~ 60%. Это делает их чрезвычайно хрупкими, и ими трудно манипулировать.
Когда придет время проверять кристаллы на предмет дифракции рентгеновских лучей, обязательно защитите их надлежащим образом, чтобы уменьшить ущерб, наносимый высокоэнергетическими фотонами рентгеновского излучения.
Не расстраивайтесь, если ваши кристаллы плохо дифрагируют, это действительно обычное дело. Вы можете улучшить дифрагирующую способность ваших кристаллов, тонко оптимизируя химические и физические свойства капли, из которой они выросли.
Если дифракция рентгеновских лучей от ваших кристаллов остается слишком низкого качества, чтобы определить структуру вашего целевого комплекса белок-ДНК с помощью рентгеновской кристаллографии, вы можете повторно растворить кристаллы и вместо этого попробовать ядерный магнитный резонанс (ЯМР) на своем образце.
Заключительные комментарии по кристаллизации комплексов белок-ДНК
Хотя все параметры, обсуждаемые в этой статье, имеют решающее значение для успешной кристаллизации вашего целевого комплекса белок-ДНК, не относитесь к ним категорично. Будьте открытыми, пробуйте разные вещи, и в конце концов у вас все получится!
Добавить комментарий