Посттрансляционные модификации (ПТМ) являются одним из наиболее быстро растущих направлений молекулярно-биологических исследований. Выявление посттрансляционных модификаций, знание того, как они работают, влияют на протеом и регулируют геном, значительно улучшит наше понимание как генетики, так и эпигенетики. В настоящее время открыто более 300 типов ПТМ, но число тех, которые были исследованы на уровне протеомов, значительно меньше.
Наиболее часто исследуемыми посттрансляционными модификациями являются фосфорилирование и ацетилирование, но к другим относятся повикитинация, SUMOylation и гликозилирование.
Как и любая научная работа, переход от теории к лабораторной практике может быть сложной частью. Существует множество методов обнаружения посттрансляционных модификаций. Эти методы сильно отличаются простотой использования, сложностью (и стоимостью!), а также доставкой результатов.
Вестерн-блоттинг для обнаружения посттрансляционных модификаций.
Эта основа биохимической лаборатории десятилетиями использовалась для обнаружения белков и была особенно полезна для идентификации ПТМ.
Гель-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом для определенных белков иногда может быть использован для обнаружения сдвига подвижности. Это полезный метод, когда вы понятия не имеете, какой модификации ожидать, так как многие модификации могут вызвать сдвиг (например, повикитиновые лестницы или сдвиг фосфорилирования).
Для обнаружения фосфорилирования, метилирования, ацетилирования и убиквитирования белков были обнаружены специфические антитела. Исследователи могут использовать эти модифицирующие специфические антитела либо на очищенном, обогащенном немодифицированном белке, либо на специфичном для посттрансляционной модификации белке.
Реагенты для добавления в гель также могут быть использованы для обнаружения ПТМ через вестерн-блоттинг. Один из методов включает коллоидное окрашивание кумасси, после которого белки частично переносятся на подходящую мембрану. ПТМ затем иммунодетектируются с помощью флуоресцентной метки. Другие методы окрашивания включают серебро или флуоресцентный белок.
Одним из недостатков вестерн-блоттинга является то, что этот метод может быть недостаточно специфичным для идентификации индивидуального изменения белка, и не все белки обладают достаточным количеством антител, доступных для обнаружения.
Иммунопреципитация с пост-трансляционной модификацией аффинных бусин
Иммунопреципитация (ИП) является еще одной лабораторной рабочей лошадкой и может быть использована для обнаружения ПТМ. С помощью ИП можно обогатить ПТМ. Антитела, прикрепленные к твердой поверхности или смоле, будут связываться исключительно с ПТМ (или целевым белком) и изолировать белки. Затем белки могут быть проанализированы другими методами, такими как вестерн-блоттинг или масс-спектрометрия (МС).
Обнаружение посттрансляционных модификаций с помощью масс-спектрометрии
Масспектрометрия может обнаружить почти все ПТМ, а также может быть использован для идентификации неизвестных модификаций. Ковалентные изменения в белках влияют на молекулярную массу модифицированных аминокислот, поэтому различия в массе могут быть обнаружены с помощью этого метода.
Некоторые плюсы МС заключаются в том, что он очень чувствителен, может определять ПТМ в сложных матрицах, и может указывать на местоположение модификации в белковой молекуле. Метод может быть использован для более точного анализа белковых фрагментов, разделенных вестерн-блотом, иммунопрецепитацией и другими методами разделения.
Один из методов МС, в частности, тандем МС (MS/MS), может определить последовательность аминокислот в модифицированном белковом сегменте и сравнить ее с немодифицированным белком.
МС является беспристрастным подходом для поиска посттрансляционных модификаций, так как он не требует специфических антител для обнаружения белков. Тем не менее, он все еще может не обнаружить целевой белок, в зависимости от количества и доступности белка в растворе. Кроме того, метод масспектрометрии дорог, требует доступа к прибору, а также специальных знаний и опыта для запуска и анализа огромных объемов полученных данных.
Анализ in vitro для обнаружения посттрансляционных модификаций
С помощью этой техники, очищенные in vitro целевые белки исследуются, чтобы увидеть, если изменения произошли через ПТМ. Очищенный белок смешивается в пробирке со специфическими ферментами, субстратом, другими факторами и источниками энергии. После инкубации для анализа пробы используется вестерн-блоттинг.
Этот метод полезен для определения того, можно ли модифицировать белок, в частности, с помощью фосфорилирования, убиквитинации и SUMOляции. Она также может быть использована для определения того, какие регуляторные ферменты необходимы для проведения ПТМ белка. Однако для проведения анализа in vitro требуются очищенные или переведенные целевые белки, а также любые ферменты, необходимые для конкретного анализа. Поскольку эти вещества не тестируются в физиологических концентрациях, можно получить ложноположительные результаты, которых в природе не существует.
Посттрансляционная модификация в полиакриламидных гелях
Прямое окрашивание белков в акриламидном геле является еще одним методом обнаружения посттрансляционных модификаций. Определенные пятна могут идентифицировать фосфорилирование, гликозилирование или другие признаки модификации, а множественные пятна могут быть использованы для идентификации различных белков в одном и том же образце.
Некоторые красители совместимы с масспектрометрией и Вестерн-блоттингом для дальнейшего анализа.
Преимущество окрашивания заключается в том, что нет необходимости в антителах, поэтому можно идентифицировать белки, для которых нет хороших антител. Однако, эта техника не столь специфична, как тест на антитела, и может обнаружить изменения (например, фосфорилирование), которые могут быть не связаны с ПТМ.
Выбирайте свое оружие острожно
Для обнаружения посттрансляционных модификаций любой метод даст твердые результаты. Но то, что работает для вас, будет зависеть от нескольких факторов, которые широко варьируются между методами обнаружения: стоимость, доступные антитела (или вы используете антитело вообще), цель, или нет цели! Комбинации различных методов также могут хорошо работать.
Добавить комментарий