Блокировка является одним из основных процессов в любом соотношении антител/антигенов. Правильный блокирующий буфер может улучшить способность антитела связывать свой антиген, в то время как плохая блокировка может сделать специфическое связывание антител практически невозможным. Не позволяйте плохому блокированию быть камнем преткновения в ваших экспериментах по вестерн-блоттингу — читайте дальше, чтобы узнать, что такое блокирование и как выбрать правильный блокирующий буфер.
Зачем нужно блокировать
Итак, вы запустили гель, сделали перенос, и теперь у вас есть мембрана, нагруженная белком, которая просто ждет, чтобы ее исследовали. Те из нас, кто несколько раз сталкивался с Вестерн-блотом, знают, что то, что вы делаете дальше, имеет решающее значение для предотвращения неспецифического связывания антител и неспецифического сигнала на блоте. Да, ты догадался… Я говорю о блокировке. Мембраны, используемые для вестерн-блотов, имеют высокое сродство к белкам, что хорошо — вы хотите, чтобы ваши переносимые белки прилипли. Однако антитела — это тоже белки, и если они не будут должным образом блокироваться из мембраны, они тоже будут прилипать. Не потому, что Ваше антитело определило свой специфический антиген, а просто потому, что это белок. Поэтому важно проводить блокировку мембраны сразу после переноса белка и непосредственно перед инкубацией с первичным антителом. Целью блокировки является покрытие любой поверхности мембраны, на которой еще нет прилипшего к ней белка, т.е. пространства между полосами мембраны, а также между разделенными белковыми полосами. При неправильной блокировке эти промежутки схватят Ваше антитело и вызовут «неспецифическое связывание». Неспецифическое связывание может привести к ложным положительным сигналам по всему Вашему блоту — также известному как «шум» или «фон», в сущности, разрушая ваш Вестерн-блот. К счастью, блокирующие буферы могут уменьшить этот фоновый шум и улучшить соотношение сигнал-шум. Звучит просто, не так ли? Но, как и остальная часть Вашего протокола вестерна, есть много путей, по которым блокирование может пойти не так.
Плюсы и минусы 7 общих блокирующих агентов
Выбор блокирующего буфера зависит от трех вещей: антитела, интересующего вас белка и системы обнаружения. Вот 7 распространенных блокирующих буферов и несколько важных советов по их использованию:
1) Порошок обезжиренного молока
Самым дешевым и легкодоступным вариантом блокировки является сухое обезжиренное молоко. Порошковое обезжиренное молоко можно купить либо у научной компании, либо безрецептурно в супермаркете. Обычно сухое молоко используется в растворе 2,5-5%. Но будьте осторожны, молоко содержит смесь белков, включая фосфопротеины, поэтому его не следует использовать, если вы используете фосфоспецифичные антитела.
2) Бычий сывороточный альбумин (БСА)
Это очищенная альбумин-содержащая фракция из сыворотки крупного рогатого скота и, наряду с сухим обезжиренным молоком, является наиболее распространенным буфером для блокировки. Как правило, BSA-содержащие блокирующие буферы находятся в концентрации 2-5%. Тем не менее, исследователи часто варьируют концентрацию БСА по всему протоколу, чтобы использовать как можно меньше, так как это может быть дорогостоящим. Несмотря на то, что этот BSA подходит для использования с фосфопротеинами, он может содержать загрязняющие IgG или сывороточные белки, которые могут создавать неспецифический фоновый шум.
3) Рыбий желатин
Использование рыбьего желатина эволюционировало от использования предыдущего блокирующего вещества — свиного желатина. Рыбий желатин очищается от кожи холодноводной рыбы и имеет практическое преимущество, оставаясь жидким даже при низких температурах. Он используется при более низких концентрациях в диапазоне 0,1-5%. В отличие от BSA или обезжиренного молока, рыбий желатин не содержит сывороточных белков, которые могли бы вступать в перекрестную реакцию с антителами млекопитающих, минимизируя фоновый шум. Но желатин для рыбы не может быть использован для блокировки с помощью систем обнаружения биотина, так как он содержит эндогенный биотин.
4) Нормальная сыворотка (например, эмбриональная сыворотка теленка FBS, сыворотка кролика, козья сыворотка и т.д.).
Цельная сыворотка, содержащая смесь белков, также может быть использована для блокирования мембраны Вестерн-блота. Обычная сыворотка реже используется в качестве блокирующего средства, потому что она имеет мало практического преимущества по сравнению с обезжиренным молоком или BSA и является более дорогой. Нормальную сыворотку также необходимо использовать при более высоких концентрациях (~5-10%). Как и BSA, нормальная сыворотка содержит иммуноглобулины и сывороточные белки, которые могут вступать в перекрестную реакцию с антителами млекопитающих.
5) Очищенный казеин
Можно сказать, что это обломок от старого блока, так как это всего лишь очищенный молочный протеин. Вы можете использовать казеин, когда будете использовать обезжиренное молоко, но имейте в виду, что казеин — это фосфопротеин, присутствующий в цельном молоке, поэтому этот буфер также непригоден, если вы пытаетесь обнаружить фосфопротеины.
6) Запатентованные коммерческие буферы (например, SuperBlock компании Thermo Fisher Scientific).
Обычно они содержат чистые фракции таинственного запатентованного белка. Преимущество этих буферов в том, что вы знаете, что нет никаких фосфопротеинов, иммуноглобулинов, альбумина или биотина (плохие парни в других блокирующих буферах), но недостаток в том, что коммерческие буферы стоят дороже. Протоколы специфичны для каждого коммерческого буфера, поэтому обратитесь к рекомендациям производителя. Большой плюс к этим блокирующим буферам в том, что некоторые из них достаточно быстрые, что позволяет вам быстрее переходить к шагам обнаружения.
7) Поливинилпирролидон (PVP).
PVP является небелковой альтернативой обычным блокирующим буферам. Несмотря на то, что впервые он был опубликован в 1993 году, он является новичком на блоке с точки зрения технологии блокировки. PVP — это водорастворимый полимер, который легко связывается с нитроцеллюлозной и PVDF мембраной (наиболее распространенные мембраны для вестерн-блоттинга). PVP обычно используется в концентрации 0,5-2% и часто в сочетании с другими блокирующими агентами, такими как очищенный казеин. PVP особенно полезен для обнаружения мелких белков, которые могут быть замаскированы более крупными блокирующими молекулами, такими как BSA.
Какой буфер использовать
Итак, теперь, когда вы выбрали лучший блокирующий агент для вашего эксперимента, в какой буфер его следует разбавить?… PBST или TBST? Честно говоря, для большинства применений это не имеет значения. Исторически сложилось так, что TBST (Tris-Buffered Saline solution with Tween-20 detergent) является предпочтительным средством для обнаружения фосфопротеинов, и его всегда следует использовать, если Вы используете системы обнаружения конъюгатов щелочной фосфатазы. Но TBST менее стабилен, чем PBST (Phosphate Buffered Saline solution with Tween-20 detergent), поэтому, если Вы все же используете TBST, делайте свежие разбавления часто и не забудьте проверить pH перед использованием.
Добавить комментарий