Микроскопия структурированного освещения (SIM) — Введение

Эффект Муара

Вот краткий возрастной тест: помните ли вы, когда телеведущие носили галстуки, которые, казалось, создавали забавные узоры на экране? Ну, если вы это видели, то уже что-то знаете о принципах структурированной световой микроскопии (SIM). Ведущие и продюсеры более сознательно относились к этому в течение последних нескольких десятилетий, но вплоть до 70-х годов это причудливое явление иногда можно было наблюдать.

То, что происходило на этих изображениях, заключалось в том, что видимый размер определенных деталей на изображении был очень близок к разрешению экрана, или размеру пикселей. Это почти полное совпадение двух шаблонов, один на изображении, а другой на самом экране, создало третий шаблон, который менялся по мере изменения относительного положения двух других шаблонов. Это явление называется эффектом Муара и является, по сути, оптическим эквивалентом звуковых ударов, вызванных интерференцией между двумя звуковыми волнами одинаковой частоты.

Эффект Муара не только раздражает телевизионные команды и зрителей — он также может быть использован в интересах микроскопистов. SIM — это технология широкоугольной микроскопии, использующая тот же эффект для получения информации с более высоким разрешением по сравнению со стандартной дифракционной микроскопией.

Как работает микроскопия структурированного освещения?

SIM работает с помощью структурированного освещения, как правило, полосами, чтобы возбудить образец. Положение и ориентация полос изменяются несколько раз, и излучаемый флуоресцентный сигнал записывается для каждой из этих позиций.

Взаимодействие между возбуждением и образцом приводит к появлению муарового рисунка в результате интерференции между мелкополосным возбуждающим рисунком полос и субдифракционными деталями в излучении образца. Эти модели содержат высокочастотную пространственную информацию, которую невозможно расшифровать с помощью дифракционных изображений.

После обработки по специализированному алгоритму эта информация может быть извлечена из необработанных данных нескольких изображений. Полученное в результате реконструирования конечное изображение имеет латеральное разрешение, приблизительно вдвое превышающее разрешение дифракционных ограничивающих устройств, т.е. близкое к 100-130 нм.

В трехмерной SIM-карте освещение модулируется в трех измерениях, что также позволяет удвоить осевое разрешение, с результирующим разрешением в диапазоне от 250 до 350 нм. Такое разрешение может быть достигнуто на основе реконструкции 10 — 15 изображений.

Существует сложная зависимость между количеством поворотов сетки и разрешением изображения. Результат в значительной степени зависит от частоты сеток, количества углов поворота и геометрических соотношений между линиями сетки и особенностями образца. Окончательное разрешение может быть увеличено за счет увеличения количества вращений сетки, но только за счет скорости дискретизации и увеличения фотообесцвечивания.

Преимущества структурированной световой микроскопии

• Совместимость со всеми обычными флуорофорами.
• Быстрая запись большого поля зрения.
• Очень высокая чувствительность с помощью соответствующей камеры.
• Очень высокое улучшение контрастности по сравнению с широкополосной микроскопией.
• Трехмерное сечение тонких образцов (например, клеток).
• Совместимость с приложениями для живых клеток.

Недостатки структурированной световой микроскопии.

• Только умеренное улучшение бокового разрешения по сравнению с другими методами сверхвысокого разрешения.
• Длительность времени обработки (от 1 до 30 секунд) необходима для получения изображений высокого разрешения.
• Ошибки в положении сетки, калибровке системы, несоответствие индекса преломления и/или плохое качество образцов могут привести к появлению артефактов и серьезно скомпрометировать конечный результат.
• В принципе не подходит для использования с толстыми образцами — хотя алгоритмы для преодоления этой проблемы существуют.

Варианты микроскопии структурированного освещения

Исходя из вышеизложенных принципов, область микроскопии SIM значительно развилась за последнее десятилетие или около того, и появилось несколько вариантов. Одним из таких примеров является SSIM (микроскопия с насыщенным структурированным освещением). В этой методике используется нелинейная зависимость скорости излучения флуорофора от интенсивности возбуждающего лазера. В ней применяется синусоидальный рисунок освещения с пиковой интенсивностью, приближающейся к интенсивности насыщения флуорофора, что создает муаровый рисунок в результате появления насыщенных областей. Отбеливание является одним из очевидных недостатков этой техники, что делает ее пригодной только для более устойчивых к излучению флуорофоров.

Другой вариант появился в результате комбинации SIM и стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM), в корреляционном подходе SIM/STORM. Появились и другие комбинации и разработки.