Неспецифическое связывание может оказать серьезное влияние на количественное определение и надежность данных при проведении вестерн-блоттинга.
Давайте рассмотрим некоторые способы улучшения пятен, в порядке относительной важности.
Блокировка
Это самый важный этап — если вы не заблокируете незанятые участки на мембране, антитела будут связываться непосредственно с мембраной. Если у вас проблемы с неспецифическим связыванием, подумайте:
- Увеличение времени и/или температуры блокирования, при которой вы блокируете
- Использование более высокой концентрации белка в буфере
- Добавление 0.1% Твин к буферу
- Возможно стоит выбрать другой блокирующий буфер
Промывка
Вся цель промывки — очистить мембрану от неспецифических, слабых взаимодействий, которые в конечном итоге приводят к появлению фонового шума. Чрезмерная промывка может уменьшить сигнал, представляющий интерес, но это не проблема, если у вас высокий фоновый шум. Рассмотрим один из следующих вариантов или их смесь:
- Выберите частоту (например, 5 раундов по 6 минут вместо 3 раундов по 10).
- Повышение скорости/амплитуды встряхивателя или промывка в течение большего времени.
- Добавление 0,1% Твинв буфер для промывки.
Вторичные антитела и визуализация
- Не превышайте рекомендуемое время инкубации, как для вторичных антител, так и для вашего визуализирующего средства!
- Снизьте концентрацию вашего вторичного антитела. 1:1000 разбавление является довольно стандартным, но 1:5000 или даже 1:10000 может быть указано.
- Протестируйте мембрану (и субстрат) на пустую необработанную мембрану, чтобы убедиться, что вы не получите сигнал, когда нет вторичной связи.
- Экспериментируйте с различными протоколами визуализации и настройками контраста, чтобы найти те, которые могут дать чистый сигнал с минимальным временем экспозиции. Если вы используете пленку, вы можете рассмотреть возможность переключения на устройство формирования изображений.
Первичное антитело
Слишком много, слишком мало…
- Нахождение оптимальной концентрации при использовании слишком большого количества первичного титрования может привести к постороннему связыванию, а слишком малое — к проблемам с отсутствием сигнала вообще.
- Первичное антитело может быть просто более низкого качества для ваших целей, а другое (с использованием другого эпитопа или метода очистки) может работать лучше.
Подготовка образца и геля
Слишком концентрированные или плохо денатурированные образцы не будут отделяться чисто — это важно для появления резких полос.
- Подумайте о снижении концентрации белка в образце
- Если это не вариант (из-за низкого содержания белка), убедитесь, что у вас есть подходящий размер геля.
- Попробуйте нагреть дольше во время подготовки или использования различных денатурирующих и/или восстановительных средств.
Закрытие Соображения для уменьшения неспецифического связывания
При тонкой настройке протокола для конкретного белка или антитела, лучше всего менять только одну вещь за раз, чтобы изолировать проблему. Вышеуказанный список в порядке важности, для того, чтобы улучшить ваш блот, начинайте сверху и работайте вниз!
И последнее замечание: в то время как фоновый сигнал везде является проблемой, неспецифические группы не всегда являются ошибкой, особенно если одна и та же группа найдена последовательно. Если присутствует правильный эпитоп, то первичное антитело будет связано — это может означать, что ваш белок был ковалентно модифицирован или переварен врожденной протеазой (не забудьте про ингибиторы), или же это может быть альтернативно сращивающийся родственник.
Добавить комментарий