Учитывая быстрые темпы разработки и внедрения технологий редактирования генома, неудивительно, что оригинальная система CRISPR-Cas9 была успешно модифицирована некоторыми очень умными учеными. Мы больше не ограничиваемся «простым» случаем редактирования генетической последовательности вашей биологической системы по выбору, но есть множество вариантов, которые позволяют вам выполнять и целевое редактирование эпигеномов. Ниже приводится обсуждение новых форм системы CRISPR-Cas9 для редактирования эпигеномов и того, что они могут сделать для ваших исследований.
Зачем мне редактировать эпигеном?
Система CRISPR-Cas9 является невероятно мощным инструментом для создания модификаций последовательностей ДНК. Наибольшим преимуществом этой системы является то, что эти модификации могут быть нацелены на конкретные последовательности с помощью направляющих РНК (gRNA). До сих пор эпигеномные исследования имели тенденцию фокусироваться на анализе эпигенетических изменений в контексте лечения наркозависимости или в качестве маркеров заболевания. Кроме того, эпигенетическая модуляция была нарушена из-за отсутствия инструментов, позволяющих вносить конкретные, целенаправленные изменения. До настоящего времени такие модификации проводились, например, с использованием глобальных метилирующих или деметилирующих агентов.
Если ваша исследовательская гипотеза сосредоточена на эпигенетической регуляции экспрессии генов, то использование направленной модификации эпигеномов на основе CRISPR-Cas9 позволит вам проверить это беспрецедентным образом.
Основополагающий принцип редактирования эпигенома
Редактирование эпигеномов особенно полезно для исследования экспрессии генов в процессе развития, при целом ряде заболеваний и старении, не говоря уже о нескольких областях применения. Так как же вы можете выполнять редактирование эпигеномов? Каждый метод предполагает использование модифицированного фермента Cas9, ферментативно «мертвого» Cas9 (dCas9), который был разработан для предотвращения разделения ДНК-нитей.
Затем dCas9 связывается с эпигенетическим ферментом-эффектором, так что dCas9 и присоединенный эпигенетический эффектор могут быть направлены в интересующую геномную область с помощью gРНК обычным способом. Однако вместо Cas9, режущего ДНК, эпигенетический эффектор способен модифицировать эпигеном в этой области. Ниже приведены введения к четырем широко принятым эпигенетическим модифицирующим системам.
Транскрипционная репрессия через редактирование эпигеномов
Метилирование ДНК с использованием dCas9-Dnmt3a
ДНК-метилтрансфераза (ДНМТ) — фермент, отвечающий за перенос метильной группы в цитозин базы ДНК, если этот цитозин находится в составе динуклеотида CpG (цитозин, за которым сразу следует гуанин). Метилирование на промоторах генов приводит к транскрипционному подавлению этого гена. Направив ДНМТ на конкретную геномную область по каналу dCas9, можно вызвать метилирование ДНК в этом месте и подавить экспрессию генов.
Впервые в 2016 году было показано, что использование этой системы с одной gРНК позволяет индуцировать метилирование ДНК на конкретном промоторе в пределах ~35 пар оснований в широкой области. Однако при использовании нескольких gРНК, нацеленных на соседние части промотора, метилировалась и успешно подавляла экспрессию гена более широкая область. Дополнительные данные, также в 2016 году, успешно индуцировали метилирование ДНК и подавленную экспрессию на других локусах.
Транскрипционная репрессия с помощью dCas9-KRAB
Фермент KRAB (Krupple-asciated box) является транскрипционным репрессором, который вызывает подавление экспрессии генов путем набора корепрессорных белков. Впоследствии было показано, что система dCas9-KRAB глушит множественные гены в конкретном локусе и сопровождается триметилированием гистонов в этом регионе, снижая доступность хроматина. Более эффективная адаптация этой системы была описана с добавлением дополнительного фермента-эффектора — MeCP2.
Активация транскрипции через редактирование эпигеномов
ДНК-деметилирование с помощью dCas9-Tet1
Десять-одиннадцать транслокационная метилцитозин диоксигеназа 1 (Tet1) — это деметилирующий фермент. Он ускоряет преобразование метицитозина в 5-гидроксиметилцитозин, что является первым шагом в процессе деметилирования. В 2016 году в нескольких публикациях описывалось развитие и применение системы dCas9-Tet1 для стимулирования метилирования ДНК в целевых геномических точках. Например, экспрессия двух разных генов регулировалась деметилированием их промоторных областей в различных клеточных системах. В модели рака молочной железы экспрессия BRCA1 была спасена путем направленного деметилирования промоторной области, в то время как несколько генов стали целью дальнейшего исследования.
Модификации гистона с помощью dCas9-p300
Фермент гистоноацетилтрансферазы p300 активизирует экспрессию генов путем ацетилирования гистонов и индукции ремоделирования хроматина. Впервые он был соединен с dCas9 в 2015 г. и показал катализатор ацетилирования гистона 3 лизин 27 в целевых генетических регионах, при этом «основной домен» p300 оказался более эффективным, чем полноразмерная версия белка. Этот метод индукции экспрессии генов является высокоспецифичным и работает как в проксимальных, так и в дистилляционных регионах, а также в регионах-промоторах.
Как обсуждалось выше, каждый из этих методов работает немного по-разному и будет оказывать разное влияние на систему моделирования, с которой вы работаете. Если вы рассматриваете редактирование эпигеномов в качестве одного из подходов к изучению, тщательно продумайте наилучший подход и обратите пристальное внимание на литературу.
Существует постоянно расширяющийся список публикаций, использующих эти версии системы CRISPR-Cas9, так что, скорее всего, есть одна публикация, которую можно использовать в качестве шаблона. Некоторые примеры конструкций dCas9 можно найти на веб-сайте «Addgene CRISPR Plasmids and Resources».
Добавить комментарий