За последние несколько лет инструменты редактирования генома на основе нуклеаз штурмом взяли лаборатории наук о жизни и дали исследователям беспрецедентный контроль над последовательностями геномной ДНК. Но это не все события в дивном новом мире редактирования генов.
Нет более надежного способа понять, куда мы идем, чем вспомнить, где мы были. Так что отправляйтесь с нами в машину времени для путешествия в прошлое.
1987 год. Прошло всего около десяти лет с тех пор, как был изобретен метод Сэнгера для секвенирования ДНК, и чуть более 30 лет с того момента, как была решена структура ДНК. Проект генома человека еще не начался — этого не произойдет еще три года или около того. На данный момент полных баз данных генов не существует, хотя предварительная работа уже началась или скоро начнется. Есть, конечно, последовательности некоторых генов, но в настоящее время вряд ли кто-нибудь знает что-либо о каком-либо геноме во всей его полноте.
Конечно, даже сейчас, в 1987 году, более творческие представители нашего вида размышляют о том, что может быть, через несколько лет мы сможем по желанию разрезать и изменять гены, не дожидаясь годами, пока программы разведения дадут свои плоды.
Даже более здравомыслящие ученые соглашаются со снисходительным кивком. И, возможно, просто возможно, однажды мы сможем редактировать эти самые гены в любой момент, когда захотим, заставляя их создавать дизайнерские белки. Несколько менее восторженное согласие от ученых реалистов: И наступит день, когда это можно будет сделать быстро и дешево, используя недорогие наборы, доступные на рынке. Скептики, в отличии от реалистов заявляют: «Это невозможно сделать! Одно дело вырезать и вставлять гены, но химическая точность, необходимая для изменения остатков in situ выше всего, что только можно представить! Как вы собираетесь выбирать цель для столь тонких изменений? Как вы убедитесь, что изменения относятся только к одному сайту? Все это порождает слишком большое количество трудностей. Дешевое и удобное редактирование генома просто невозможно!».
Редактирование ДНК становится обычным делом
Теперь вернемся к настоящему. Сегодня относительно дешевое и удобное редактирование ДНК не только возможно, но и становится рутиной. Как удалось добиться таких результатов за короткое время? Эта история состоит из трех глав, и эти главы озаглавлены «Цинковые пальцы», «ТАЛАНЫ» и «CRISPR». И, как и все хорошие истории, каждая глава основывается на вышеизложенном, и все же они все развивают общую тему. Все главы объединены одним мотивом — «вырезать и ремонтировать». Все три метода следуют одинаковой схеме. Первое — найдите способ разрезать вашу ДНК в определенной точке. Подождите, пока клетка восстанавливает ДНК, обманывая механизм ремонта, заставляя сделать небольшую «ошибку», вводя ваше письмо в код, а не в исходный код.
Давайте начнем со второй части (трюк, который я выучил с детективной фантастикой — сначала прочтите конец, чтобы избежать разочарования). Как эти три метода редактирования генома вводят механизм репарации в добавление «нашего» нуклеотида? К счастью, встроенный редактор клетки не учитывает детали. Когда он пытается исправить разрыв, его можно обмануть, используя праймер, который не совсем соответствует шаблону. Поэтому, если мы предоставим именно такой праймер, он будет включен в ДНК, и мы сможем затем провести ПЦР. Представьте себе, что вы помогаете кому-то починить гобелен и «услужливо» протягиваете ему почти правильную нить.
Теперь давайте рассмотрим первую часть — разрезание ДНК в нужном месте. Разрезать ДНК легко, просто используйте нуклеазу. Сложность заключается в том, чтобы сделать разрез именно там, где вы хотите, и нигде больше. Что мы действительно хотим здесь, так это белок, который, скажем, направляет нуклеазу только в один сайт, указанный последовательностью ДНК.
Много вопросов, но счастливый случай наступил, когда люди начали присматриваться к тому, как 5S РНК хранится в незрелых ооцитах Xenopus . Было замечено, что неоплодотворенные яйца содержали большое количество фактора (фактически первого описанного эукариотического фактора транскрипции), который связывал и РНК, и ген, кодирующий РНК, и который был необходим для контроля скорости транскрипции.
Это было именно то, что мы искали — белок, который связывает определенную последовательность ДНК и который делает это согласно некоторым предсказуемым правилам последовательности. При более внимательном рассмотрении структуры был идентифицирован одноименный «цинковый палец», названный так потому, что он держится за ДНК. Важность этого открытия состояла в том, что был обнаружен новый ДНК-связывающий мотив и что последовательность придала специфичность одному нуклеотидному триплету пригодным для использования способом. Но было кое-что еще: вы могли также связать вместе несколько пальцев, каждый со своей специфичностью, чтобы создать связывающий пептид, специфичный для данной последовательности.
Одна из первых вещей, сделанных с этим открытием, состояла в том, чтобы соединить цинковые пальцы с активаторами или репрессорами. Вскоре ученые начали объединять их с нуклеазами для создания нуклеаз цинкового пальца (ZFN). Объединив несколько пальцев, соответствующих сайту, который вы хотите изменить, и объединив его с нуклеазой, вы можете объединить все это с гомологичным восстановлением, чтобы внести любое изменение, которое вы хотите.
Но оказалось, что с нуклеазами из цинкового пальца не так легко работать, как вы уже догадались. Для начала есть проблемы со спецификой. И нет волшебных формул для преодоления этих проблем. Чаще всего речь идет об утомительной оптимизации реагентов, без гарантии успеха. ZFNs также дороги, потому что вы должны синтезировать палец.
От цинковых пальцев до ТАЛЕНОВ…
Итак, давайте закроем главу о ZFN и откроем главу об эффекторных нуклеазах, подобных активатору транскрипции (TALEN). Во многих отношениях TALEN являются родственным методом для ZFN, но с другим происхождением. Все это, как и многие другие открытия, пришло из неожиданного квартала. Исследователи интересовались, насколько тип бактерий (Xanthomonas) эффективен при заражении растений-хозяев. Это было важно, потому что инфекции Xanthomonas влияли на продуктивность сельскохозяйственных культур, таких как рис, перец и помидоры.
Оказалось, что бактерии секретируют белок в цитоплазму растительных клеток, и этот белок находит свой путь в ядро, где он связывается с ДНК. Это связывание было специфическим и должно быть таким, чтобы активировать и подавлять определенные гены путем копирования факторов транскрипции хозяина.
Эти белки TALE (подобные активаторам транскрипции) состояли из трех модульных частей: домена, нацеленного на ДНК, другого домена, который переносит белок к ядру, и, наконец, домена транскрипции. Итак, поменяйте местами транскрипционный домен для нуклеазы, и вы получите нечто очень похожее на ZFN — но с одним отличием: каждый повтор домена ДНК-нацеливания в TALE соответствует не триплету, а одному нуклеотиду, давая беспрецедентную гибкость в разработке последовательности распознавания. Объединяющий крик «один мономер, один нуклеотид» пронесся от одного стенда редактирования генов к другому, отодвинув ZFN в сторону и выиграв заветный «Метод года» Nature Methods в 2011 году.
Впрочем, для ТАЛЕНОВ не все так гладко. Еще раз эта старая проблема, сторонние эффекты, подняла свою уродливую голову. К сожалению, эффективность связывания различных мономеров, распознающих ДНК, не одинакова, поэтому иногда можно получить связывание с сайтами, которые отличаются от мишени несколькими нуклеотидами. Тем не менее, TALEN открыли множество новых возможностей для редактирования генов, так как были внесены постоянные изменения в протоколы и алгоритмы проектирования последовательностей.
… и, наконец, CRISPR
Тем не менее, преобладание TALEN было недолгим, благодаря появлению CRISPR всего лишь два года спустя (кластерные регулярные перемежающиеся короткие палиндромные повторы). Комплексы CRISPR были первоначально обнаружены у очень примитивных организмов (Archaea) и считаются адаптивной иммунной системой бактерий. CRISPR состоит из двух компонентов: «направляющей» РНК, которая выполняет функцию направления молекулы к желаемой ДНК-мишени (например, цинковым пальцам или мономерам TALEN) и замечательному ферменту под названием Cas-9, который выполняет разрезание под Направление гида РНК.
Преимущество, которое дает CRISPR над ZFN и TALEN, просто — чтобы изменить свою цель, все, что вам нужно сделать, — это создать соответствующую направляющую РНК. Вы используете один и тот же фермент Cas9 независимо от вашей цели. Не перестраивать новый белок каждый раз, когда вы хотите попробовать новую цель. И вам не нужно останавливаться на одной цели. Более того, добавляя несколько направляющих РНК одновременно, можно одновременно поражать любое количество целей. CRISPR также не ограничивается изменениями в одной базе, так как вы можете добавлять довольно длинные последовательности (это тоже можно сделать с TALEN, но не так легко).
Теперь я уверен, что наиболее вредным из наших читателей будет интересно: «Что произойдет, если ген, который я вставил с CRISPR, просто оказался также и конструкцией CRISPR?» Ответ будет таким: ген вставит себя в комплементарную ДНК и в течение последующих поколений обеспечит его быстрое распространение по всему виду. Это называется генным влечением, и считается достаточно жизнеспособным предложением, чтобы поддержать предположение об уничтожении видов вредителей и устранении вызывающих болезни мутаций по всему виду. Страшно? Так и должно быть, и угрозы достаточно, чтобы Национальные академии наук США опубликовали отчет, содержащий ряд рекомендаций по безопасности прошлым летом.
Мечтатели были правы
Таким образом, мы можем вернуться в нашу машину времени и вернуться в 1987, чтобы сказать мечтателям, что они были правы, а реалисты ошибались. Но что если вместо этого мы перейдем не в прошлое, а в будущее, увидим ли мы действительно, как редактирование генома изменит наш мир?
Я думаю, что можно представить, что реалисты будут говорить прямо сейчас. Они напомнили бы нам, что шумиха над редактированием больше, чем реальность. Разве мы не говорили ранее, что ZFN, TALEN и CRISPR имеют эффекты за пределами ислледований? Давайте посмотрим поближе на наш метод — является ли CRISPR тем, для чего он предназначен (конечно, с учетом незавершенной рутинной работы по точной настройке метода и всей оптимизации, которую еще предстоит сделать)? На самом деле, один из самых серьезных недостатков CRISPR — это непреднамеренное следствие одного из его больших преимуществ — специфики. Если последовательность вашей цели отличается от ожидаемой только одним остатком, CRISPR, вероятно, потерпит неудачу. И даже тогда, выживут ли клетки после трансфекции? И у вас есть лучший гид РНК? Или лучший шаблон донора (для гомологичного ремонта)? CRISPR легок, но не тривиален.
К сожалению, слава CRISPR и путь к славе привели к противоречиям. Около года назад исследователь из Китая Хан Чунью заявил, что у него есть лучшая альтернатива CRISPR в гене, называемом NgAgo. Он сказал, что он более точный и более гибкий, чем CRISPR. Проблема заключается в том, что несколько попыток воспроизвести эти результаты в других лабораториях не увенчались успехом.
Но CRISPR слишком хороший инструмент, чтобы выбрасывать его только потому, что он не идеален. Например, чтобы преодолеть ограничения по размеру, чтобы упаковать в вирус, приходится пользоваться меньшими версиями cas9, такими как Cpf1 (Nature Biotechnol). Другие производят варианты Cas9, которые не просто режут, а напрямую обменивают остатки ( Nature 533: 420-24).
Проблемы клинического применения
Редактирование генома сталкивается с особыми проблемами, поскольку оно пытается войти в клинику. Самая большая проблема — попасть в клетки. На сегодняшний день полезная нагрузка обычно доставляется вирусными векторами, но эти векторы часто ограничены по своей несущей способности и специфичности к цели, а также по необходимости согласовывать все это с иммунной системой. Существует несколько впечатляющих проверочных концепций методов редактирования генов на моделях животных, но перевод в клинику все еще в значительной степени недоступен.
Но все это изменилось в январе этого года. Лондонская больница на Грейт-Ормонд-стрит объявила, что годовалая девочка Лейла, хотя и не реагирует на традиционное лечение, излечилась от острого лимфобластомического лейкоза. Хотя в настоящее время проводятся клинические испытания, в которых Т-клетки пациента удаляются, а затем перепрограммируются с использованием ТАЛАНОВ для экспрессии белков, убивающих рак, Лейле этот подход не был открыт, поскольку она была такой маленькой — у нее просто не было достаточно Т-клеток, чтобы начать запуск иммунного ответа. Таким образом, команда больницы на Большой Ормонд-стрит забрала Т-клетки у другого донора и использовала ТАЛАНЫ не только для добавления убивающего рак белка, но и для того, чтобы заставить замолчать гены, которые бы пометили донорские клетки как «чужеродные» и, следовательно, вызвали иммунный ответ Лейлы.
Инструменты редактирования генов также могут быть использованы как новый способ борьбы с инфекциями. Существуют обнадеживающие признаки того, что вы можете нацеливаться не только на геном хозяина, но и на геномы вирусов, которые заразили хозяина. Группа Брайана Каллена в Медицинском центре Университета Дьюка, Дарем, США, показала, как CRISPR может выбить опасные папилломавирусы, которые вызывают рак шейки матки и другие виды рака человека, в то время как Kamel Khalili и Wenhui Hu из Temple Университетская медицинская школа, Филадельфия, утверждают, что есть веские основания надеяться, что CRISPR сможет обеспечить столь желанное лекарство от ВИЧ-1 / СПИДа.
Будущее почти здесь
К сожалению, машина времени существует только в нашем воображении (как когда-то редактирование генома…). Но мы, тем не менее, готовы рискнуть предположить о будущем редактирования генома. При дальнейшей подстройке параметров основная цель редактирования генома более или менее уже достигнута. Разработка производных Cas9, таких как те, которые предназначены для непосредственного редактирования остатков, приведет к завершению фундаментального метода. Родственные методы редактирования генов, такие как гамма-пептид-нуклеиновые кислоты, которые связываются с ДНК и вызывают механизм эндогенного восстановления клетки, добавят больше цветов в постоянно растущую палитру. Даже эта надвигающаяся глухая стена проблемы — как доставить ее в клетки — рушится.
Одна из двух последних задач лежит на ученых-практиках. Принимая во внимание такую манипулятивную власть над геномом, какие вопросы можно задать наиболее? Другой лежит на регулирующем сообществе. Имея в виду генные побуждения, что мы смеем делать с этим, и что мы должны запретить? Действительно, что мы можем запретить?
Добавить комментарий