Клеточная биология вступает в Эпоху Света с помощью спектра новых оптогенетических инструментов, доступных для наблюдения функций белков с помощью света. Когда-то сфера компетенции нейробиологов, в последнее десятилетие появилось множество новых светорегулируемых областей, которые в настоящее время используются для освещения темных углов базовой клеточной биологии. Ниже приведен ряд советов и хитростей по настройке системы в области Light Oxygen Voltage 2 (LOV2).
Почему следует выбирать оптогенетику?
Существует несколько основных причин, по которым вы, возможно, захотите применить оптогенетическую систему вместо классических генетических манипуляций или фармакологических пертурбаций. Быстрая обратимость светорегулируемых белков означает, что сигнальные пути можно включать и выключать буквально одним щелчком переключателя, избегая надоедливой подрывной деятельности или нормализации, наблюдаемой при генетических нокаутах, нокаутах и нокаутах. Внедрение светоуправляемых белков параллельно с эндогенными сигнальными путями во времени также сводит к минимуму нецелевые эффекты, характерные для режимов лечения наркозависимости. В конечном счете, оптогенетика может обеспечить беспрецедентную пространственно-временную точность при манипулировании клеточной активностью.
Домен LOV2
Домен LOV2 является, пожалуй, самым удобным оптогенетическим инструментом для начинающих. Этот домен широко распространен в растительных и грибковых светосигнальных белках, причем наиболее широко он используется в оптогенетике на основе фототропина-1 овса Avena sativa. При размере ~140 аминокислот домен LOV2 с меньшей вероятностью вызывает стерильное торможение, чем некоторые из его более крупных аналогов. Также желателен тот факт, что LOV2 основан на мононуклеотидном кофакторе флавина (FMN), который эндогенно экспрессируется в клетках млекопитающих. Это важно, поскольку другие системы требуют экзогенной добавки кофактора в среду или значительных генетических изменений в интересующей их клеточной линии. Кроме того, механизм светового отклика LOV2 был подробно охарактеризован, поэтому настройка системы под ваши нужды выполняется быстро и легко.
Механизмы действий
Оптогенетические инструменты можно разделить на два класса в зависимости от их механизма действия: фотокопирование или олигомеризация, индуцируемая светом.
Рис.1
Фотокопирование
Фотокаджинг позволяет включать и выключать активность белка, используя оптогенетический домен для стерильной блокировки функциональной емкости интересующего белка (POI) (Рисунок 1A). Это может включать клетку домена, регулирующего локализацию белка, например, ядерную локализацию или экспортную последовательность, или ферментативно-активный сайт, например, в киназах.
Свето-индуцируемая олигомеризация (или диссоциация)
Если вы исследуете взаимодействие двух белков, то этот метод вам подходит. Свет используется для управления взаимодействием белок-белок в точке, помеченной оптогенетическим белком, и второй Точкой интереса, помеченной взаимодействующим доменом (рис. 1B). Что касается домена LOV2, это лучше всего иллюстрирует система TULIPs Strickland et al., которая основана на фотокаджинге последовательности связывания PDZ для опосредованного взаимодействия белков-мишеней при световой стимуляции. Если вы хотите диссоциировать два белка, то система LOVTRAP — это то, что вам нужно, поскольку она работает в обратном направлении с доменом, специфичным для темного состояния LOV2 и диссоциации, управляемой светом.
Соображения по настройке
При настройке системы на базе LOV2 необходимо учитывать несколько моментов.
Выбирайте флюорофор осторожно!
Эволюция явно не имела в виду оптогенетику, когда возникали эти фотореактивные области, потому что они реагировали на широкий спектр света. Это усложняет выбор флюорофора для локализационных экспериментов; если вы не подберете его разумно, то ваш эмиссионный лазер сработает.
В области LOV2 отображаются два пика поглощения по направлению к голубому световому концу спектра. Это означает, что GFP и BFP выглядят как теги, если вам нужно визуализировать POI, одновременно контролируя LOV2-домен. Также не забудьте использовать мономерные флюорофоры, если вы проводите эксперименты по олигомеризации. Хорошим выбором являются красные и дальне-красные флуоресцентные белки, такие как mCherry, mRuby3 или iRFP670. Сам домен LOV2 излучает сигналы с длиной волны ~500 нм, что может быть удобным способом проверки системного выражения без меток.
В клетке или не в клетке?
Затем просмотрите существующую литературу по вашей точке интереса, чтобы определить наиболее подходящий оптогенетический механизм для применения. Например, является ли белок-мишень киназой или протеином? Где она обычно локализуется и изменяется ли ее функция в зависимости от модели локализации? Есть ли известные партнеры по взаимодействию? Есть ли свойство белкового или сигнального пути, который вы хотите допросить? После определения известных функциональных характеристик вашей точки интереса вы можете определить, будет ли наиболее подходящим для вашей системы метод фотосъемки или световой ассоциации (или диссоциации).
Будьте в курсе истории вопроса
Важно понимать, что в вашей системе будет определенная фоновая активность. Проще говоря, система никогда не включается и не выключается на 100%. Для улучшения соотношения сигнал/шум в вашей системе можно использовать ряд хорошо описанных мутаций, которые изменяют кинетику активации (Таблица 1). Оптимизация экспрессии белка также может помочь очистить эксперименты. Чтобы ускорить процесс тонкой настройки, постарайтесь параллельно проводить эксперименты на уровне мутации и экспрессии.
| Мутация | Период полураспада мутации (с) t1/2 |
|---|---|
| Дикий тип | 80 |
| C450G | конституционно неактивен |
| I539E | конституционно активен |
| V416T | 2.6 |
| V416L | 495 |
Таблица 1: Влияние точечных мутаций на скорость реверсирования темных состояний домена LOV2
Печать на собственном оборудовании
Наконец, доступные для 3D-печати аппаратные планы с открытым исходным кодом из лаборатории Tabor предоставляют средства для проектирования оптогенетических анализов на основе пластин. Однако я бы рекомендовал использовать адаптер для матовой акриловой пластины, так как использование фотобумаги приводит к неравномерному освещению. Этот подход может быть гораздо более высокопроизводительным, чем метод, основанный на микроскопии, хотя для настройки протоколов визуализации можно использовать модуль Fиджи Plugin, μManager.
Эта информация даст вам хорошую возможность начать, когда дело доходит до реализации домена LOV2 в ваших оптогенетических экспериментах. Теперь, когда у вас появилось понимание того, как настроить оптогенетическую систему, вы можете идти вперед и искать свет!
Добавить комментарий