Изучение эпигенома методоами секвенирования нового поколения NGS

Эпигеном сейчас в центре внимания исследований, и не без причины. Мало того, что это было связано со стадиями развития организма, но эпигенетические изменения приводят к расстройствам и связаны со многими заболеваниями человека. Итак, стоит вопрос: что именно является эпигенома?

Что такое эпигеном?

Проще говоря, эпигеном — это каждое химическое изменение ДНК или гистонов (белков, которые связываются с ДНК), которые влияют на экспрессию генов; однако, это не изменяет последовательность ДНК. Это означает, что секвенирование генома — это только половина истории, так как некоторые секреты прячутся в эпигеноме.

Как это возможно? Одной из наиболее важных (и изученных) эпигенетических модификаций является метилирование цитозина на динуклеотиде CpG. Около 70% -80% CpG-динуклеотидов метилируется в клетках человека. Однако обнаружено, что CpG-островки (последовательности с высоким процентным содержанием динуклеотидов CpG, расположенные в 5′-концевых регуляторных областях вблизи сайта начала транскрипции большинства генов человека) неметилированы в здоровых клетках. Аномальное метилирование этих сайтов может привести к нерегулируемой экспрессии генов.

Метилирование ДНК было связано с эмбриональным развитием, и данные свидетельствуют о том, что метилирование влияет на экспрессию генов. Различные типы метилирования были обнаружены на разных типах клеток, что позволяет предположить, что он играет критическую роль в молчании генов и, следовательно, в дифференцировке клеток. Важно помнить, что паттерны метилирования наследуются и поддерживаются во время нормального деления клеток, а это означает, что каждая дочерняя клетка имеет одинаковый паттерн метилирования.

Почему важно изучать метилирование?

Знание — сила. И хотя еще многое предстоит узнать об эпигеноме и роли метилирования в гомеостазе клетки, можно с уверенностью сказать, что он играет большую роль в заболевании и развитии. Действительно, аномальные паттерны метилирования были связаны с серьезными человеческими расстройствами, такими как болезни развития, такие как синдром Прадера-Вилли, аутоиммунные заболевания и рак, среди других.

Патологические паттерны метилирования, обнаруженные в опухолевых клетках, указывают на важную роль, которую метилирование играет в онкогенезе. Геном раковых клеток широко гипометилирован, что приводит к хромосомной нестабильности. Интересно, что гиперметилирование обнаруживается в генах-мишенях в раковых клетках (гены-молчали, связанные с подавлением опухолей), что позволяет метастазировать опухоль. Гиперметилирование этих генов может быть биомаркером заболевания и использоваться для ранней диагностики.

Эпигеном, в отличие от последовательности ДНК, не установлен в камне. Это означает, что эпигенетические изменения обратимы. Это открывает новую область терапевтической медицины, так как мы можем использовать метилирование, чтобы остановить эпигенетические модификации, которые приводят к болезни, и мы можем увеличить экспрессию желаемого признака для борьбы с расстройствами. При тщательном изучении это может стать большим терапевтическим преимуществом!

Как мы можем изучать метилирование?

Метилирование ДНК может быть изучено различными методами. Однако современные подходы к анализу метилирования ДНК по всему геному основаны на трех принципах:

1. Конверсия бисульфита
2. Антитело или афинное обогащение
3. Метил-чувствительные рестриктазы

С появлением Next Generation Sequencing (NGS) эти принципы были интегрированы в его платформы, чтобы получить большой набор данных о метилировании за короткое время. Мы собираемся обсудить некоторые методы, которые используют платформу NGS для изучения метилирования.

1. Конверсия бисульфита

Обработка бисульфитом превращает каждый неметилированный цитозин в урацил посредством дезаминирования. Однако метилированные цитозины устойчивы к этой модификации и поэтому не изменяются. Таким образом, мы можем различить метилированный цитозин и неметилированный. При чтении последовательности, обработанной бисульфитом, каждый цитозин, который мы находим, происходит из метилированного пятна.

• Секвенирование бисульфита всего генома

Бисульфитное секвенирование цельного генома (WGBS) — это отличный метод, который показывает статус метилирования всего генома с помощью конверсии бисульфита. Однако, поскольку он направлен на поиск всего метилома, он становится дорогостоящим из-за обязательной глубины секвенирования.

• Сокращенное представление бисульфитной последовательности

Секвенирование бисульфита с пониженной репрезентативностью (RRBS) — это метод, который также основывается на конверсии бисульфита для различения метилированной и неметилированной ДНК. Тем не менее, он также зависит от переваривания ДНК ферментами, нечувствительными к метилированию. MspI является одной из наиболее часто используемых эндонуклеаз в этой технике, так как он распознает сайт CmCGG. Этот шаг приводит к снижению стоимости, поскольку он выбирает фрагменты с CpG. Поэтому он дает нам фрагменты на серебряной пластине, которые могут быть метилированы. Поскольку этот фермент не чувствителен к метилированию, он всегда будет переваривать ДНК в определенной последовательности, даже если он метилирован. Этот метод отбирает фрагменты генома, которые могут быть метилированы, и, таким образом, контрастирует с подходом WBGS. Тем не менее, MspI может не расщеплять каждый сайт, восприимчивый к метилированию, и, следовательно, некоторые геномные области могут иметь низкий охват или могут вообще не быть представлены.

• Бисульфитовые висячие зонды (BSPP)

Этот метод сочетает преобразование бисульфита с датчиками навесного замка. Эти зонды имеют общую линкерную последовательность и гибридизуются с ДНК (предварительно обработанной бисульфитом, так что неметилированные цитозин дезаминируются в урацил). Этот продукт затем циклизуется и амплифицируется с помощью ПЦР. Прелесть всего этого в том, что зонды содержат сайт рестрикции для эндонуклеазы, так что каждый фрагмент будет иметь одинаковый размер, что делает его готовым для NGS.

Этот метод улучшает результат выхода на этапе обогащения, комбинируя специфичность отжига зондов, и амплификация с универсальными праймерами приводит к равномерному представлению фрагментов. Тем не менее, поскольку захват происходит после конверсии бисульфита, существует опасение, что он может помешать этапу захвата и, следовательно, исказить измерения метилирования.

2. Антитело или афинное обогащение

В методах обогащения антител и аффинности используются молекулы, которые специфически связываются с метилированной ДНК. Эта специфичность позволяет обогащать, поскольку вся несвязанная ДНК и, следовательно, неметилированная ДНК могут быть смыты, оставляя только метилированную ДНК для секвенирования. Методы, основанные на этом принципе, позволяют быстро и эффективно оценить метилирование по всему геному, но не дают информации об отдельных динуклеотидах CpG.

• Секвенирование иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP-seq)

MeDIP-seq использует иммунопреципитацию для обогащения метилированных фрагментов ДНК. В этом методе моноклональное антитело против метилцитозина специфически связывается с метилированными участками геномной ДНК, что приводит к удалению всей неметилированной ДНК. Таким образом, все, что останется, — это библиотека фрагментов метилированной ДНК, готовая к секвенированию.

• Секвенирование белка метил-CpG-связывающего домена (MBD-seq)

Семейство белков MBD содержит метилсвязывающий домен (MBD), и эти белки имеют сродство к симметрично метилированным сайтам. Белки MBD специфически связываются с симметричными метилированными сайтами. Следовательно, метод MBD-seq позволяет отбрасывать неметилированную ДНК и поддерживать только метилированную геномную ДНК, которая останется в качестве библиотеки для секвенирования.

3. Чувствительные к метилированию ферменты рестрикции

Расщепление эндонуклеазой является мощным инструментом в молекулярной биологии. Фактически, это была первая тактика, использованная, чтобы узнать больше об эпигеноме и метилировании ДНК.

Рестрикционные ферменты расщепляют ДНК в точных сайтах рестрикции, специфичных для каждого фермента. Некоторые ферменты чувствительны к метилированным областям и будут обеспечивать различную структуру разреза для ДНК, в зависимости от состояния метилирования сайта рестрикции. Есть несколько методов, которые переводятся в NGS. Падение этих методов связано с сайтом рестрикции эндонуклеазы — метилированные сайты могут быть скрыты в других последовательностях.

• Метил-чувствительный подсчет среза (MSCC)

Этот метод использует HpaII , чувствительный к метилированию фермент рестрикции, для разрезания геномной ДНК. Действие этого фермента предотвращается, когда его последовательность узнавания CmCGG метилирована. Следовательно, с использованием этого фермента все полученные фрагменты будут получены из неметилированных сайтов. Неметилированные фрагменты будут представлять собой библиотеку для секвенирования и могут затем определять, какие сайты метилированы.

• Метил-сл

Этот метод, так же как и MSCC, также использует эндонуклеазу HpaII для расщепления неметилированной геномной ДНК. Однако он отличается от MSCC использованием изошизомера MspI в качестве контроля. MspI нечувствителен к метилированию и поэтому расщепляет свой сайт рестрикции (CmCGG) независимо от состояния метилирования. После расщепления геномная ДНК лигируется с адаптерами NGS, выбирается по размеру и готова к секвенированию. Следовательно, все считывания, соответствующие расщеплению MspI , которые отсутствуют в библиотеке, полученной расщеплением HpaII, представляют собой фрагменты, полученные из метилированных сайтов.

• Чувствительное к метилированию секвенирование рестрикционных ферментов (MRE-Seq)

MRE-seq также основан на использовании эндонуклеаз, чувствительных к метилированию. Однако этот метод выделяется тем, что, в отличие от предыдущих методов, он использует различные чувствительные к метилированию ферменты рестрикции для получения дополнительной информации. Используя разные чувствительные к метилированию ферменты рестрикции с разными сайтами рестрикции, мы изучаем больше метилированных сайтов, потому что мы можем видеть больше сайтов. После переваривания библиотека может быть упорядочена.

Заключительные замечания

Эпигеном — захватывающая тема для дальнейшего понимания болезней и развития человека. Хотя мы многому научились, многое еще предстоит раскрыть.

Скажите нам, какой ваш любимый метод изучения эпигенома? Какой из них вы предпочитаете?