Простые методы: полимеразная цепная реакция

Умножение молекул ДНК методом ПЦРПоявление метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) радикально трансформировало биологическую науку с момента его первого появления (Кэри Муллис, 1990). Метод позволил реализовать специфическое обнаружение и наладить производство больших количеств ДНК. ПЦР дала толчок исследованиям в области генетики, таким как «Проект генома человека». В настоящее время этот метод широко используется в клинических и научных исследованиях для генной диагностики и клонирования последовательности НК, а также быстро и с высокой точностью проводить сложные количественные и геномные исследования. Одним из наиболее важных медицинских применений классической ПЦР является обнаружение патогенов. Кроме того, данный анализ используется в судебной медицине. Из-за его широкого использования важно понять основные принципы ПЦР и то, как его использование может быть изменено для обеспечения сложного анализа генов и генома.

Процесс

ПЦР представляет собой простой, но элегантный, ферментативный анализ, который позволяет амплифицировать (увеличивать количество копий) специфический фрагмент ДНК из смеси из множества молекул нуклеиновых кислот. Доктор Муллис (Mullis), открывший ПЦР, заявил, что «метод позволяет вам выбрать фрагмент ДНК, который вам интересен, и сделать столько копий, сколько вам нужно» (Mullis, 1990). ПЦР можно проводить с использованием исходной ДНК из различных тканей и организмов, включая периферическую кровь, кожу, волосы, слюну и микроорганизмы. Для ПЦР необходимы только следовые количества ДНК, чтобы генерировать достаточное количество копий для анализа с использованием обычных лабораторных методов. По этой причине ПЦР является очень чувствительным анализом.

Схема ПЦР
Принципиальная схема полимеразной цепной реакции

Каждый ПЦР-анализ требует наличия матричной ДНК, праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза является ключевым ферментом, который связывает отдельные нуклеотиды вместе с образованием конечного продукта реакции. Нуклеотиды включают четыре основания — аденин, тимин, цитозин и гуанин (A, T, C, G). Они действуют как строительные блоки, которые используются ДНК-полимеразой для создания результирующего продукта. Праймеры в реакции указывают на ДНК-продукт, подлежащий амплификации. Они представляют собой короткие фрагменты ДНК с определенной последовательностью, комплементарной ДНК-мишени, которая должна быть обнаружена и амплифицирована. Они служат точкой расширения ДНК-полимеразы.

Амплификатор Verity
Амплификатор Invitrogen Verity

Вышеупомянутые компоненты смешивают в пробирке или 96-луночном планшете, а затем помещают в амплификатор (или термоциклер), что позволяет проводить повторяющиеся циклы амплификации ДНК на трех основных этапах. Прибор имеет тепловой блок с отверстиями, в которые вставлены пробирки или планшеты, содержащие реакционную смесь. Амплификатор поднимает и понижает температуру блока на дискретных, точных и запрограммированных этапах. Реакционный раствор сначала нагревают выше точки плавления двух комплементарных нитей ДНК-мишени, что позволяет разделить двухцепочечную молекулу на отдельные нити, процесс, называемый денатурацией. Затем температуру снижают, чтобы позволить праймерам связаться с целевыми фрагментами ДНК, процесс, известный как гибридизация или отжиг. Отжиг между праймерами и ДНК-мишенью происходит только в том случае, если они комплементарны в последовательности. Температура снова повышается, и в это время ДНК-полимераза способна расширять праймеры путем добавления нуклеотидов к развивающейся нити ДНК. При каждом повторении этих трех шагов число копируемых молекул ДНК удваивается.

В настоящее время на рынке представлено очень большое количество амлификаторов для ПЦР различных производителей, таких как Thermo Fisher Scientific, Eppendorf, Roche и другие.

Заказать амплификатор, а также получить консультацию специалистов по подбору оборудования и расходных материалов вы можете на сайте компании Пущинские лаборатории www.laboratorii.com

Применение в медицине

В клинической диагностике метод ПЦР получил очень широкое распространение благодаря своей высокой чувствительности а также относительно небольшому (от 20 до 60 минут) времени проведения анализа. Используется он в областях, перечисленных ниже:

  • Онкология.
  • Урология.
  • Гематология.
  • Гастроэнтерология.
  • Пульмонология.
  • Физиатрия и прочие медицинские разделы.

С помощью ПЦР определяют такие заболевания, как гепатиты C и B, ВИЧ, СПИД, хламидиоз и многие другие. Проводится анализ методом полимеразной цепной реакции на образцах крови.

Анализ продукта ПЦР

Существует два основных способа визуализации продуктов ПЦР

  • окрашивание амплифицированного ДНК-продукта химическим красителем, таким как бромид этидия, который интеркалирует между двумя нитями дуплекса или
  • помечая ПЦР-праймеры или нуклеотиды флуоресцентными красителями (флуорофорами) до амплификации.
Электрофорез в агарозном геле
Электрофорез в агарозном геле (Источник wikipedia.org)

Последний метод позволяет непосредственно помещать эти метки в продукт ПЦР. Наиболее широко используемым методом анализа продукта является использование электрофореза в агарозном геле, который разделяет продукты ДНК по размерам и заряду. Данный вид электрофореза является самым простым методом визуализации и анализа результатов ПЦР, который позволят определить наличие мишени.

Полимеразная цепная реакция, используемая для обнаружения конкретной цепи ДНК, называется качественной. Качественная ПЦР является хорошей методикой получения ДНК для клонирования или идентификации патогенна.

Количественная ПЦР

Real-time амплификатор QuantStudio
Real-time амплификатор QuantStudio

Количественные данные в реальном времени (qRT-PCR, реал-тайм ПЦР) позволяющие получить дополнительную информацию помимо простого обнаружения определенной последовательности. Реал-тайм ПЦР указывает, какая часть конкретной ДНК или гена присутствует в образце. qRT-PCR позволяет одновременно обнаруживать и количественно определять продукт ПЦР в режиме реального времени, в то время как он синтезируется. Два распространенных метода, используемых для обнаружения и количественного определения продукта, включают  флуоресцентные красители, которые неспецифически интеркалируют с двухцепочечной ДНК и последовательно-специфичные ДНК-зонды, состоящие из флуоресцентно меченных последовательностей. Флуоресценция возникает только после гибридизации зонда с его комплементарной ДНК-мишенью. ПЦР в реальном времени можно комбинировать с обратной транскрипцией, которая позволяет превращать РНК в кДНК (обратная транскрипция), после чего количественную оценку кДНК выполняют с помощью qPCR. Количественное определение желаемого гена во время экспоненциальной амплификации позволяет избежать проблем, связанных с конечной точкой ПЦР, которая анализируется после завершения окончательного цикла ПЦР.

Микропробирки для ПЦР
Микропробирки для ПЦР

Анализ опухолей является идеальным примером использования ПЦР. Ее можно использовать для выделения и амплификации ДНК генов-супрессоров опухолей или протоонкогенов. В свою очередь, количественная ПЦР может быть использована для количественного определения  выделенного конкретного гена. С другой стороны, количественная ПЦР может быть использована для анализа отдельных клеток и количественной оценки любой комбинации ДНК, мРНК и белков.

Преимущества и ограничения ПЦР

Для ПЦР существует несколько преимуществ. Во-первых, это простой для понимания метод, который быстро дает результаты и использования. Во-вторых, это высокочувствительный метод, способный производить огромное количество копий определенного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. Это справедливо и для количественной реал-тайм ПЦР, но она имеет преимущество количественного определения синтезируемого продукта. Таким образом, его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микробах или других болезненных состояниях.

Хотя ПЦР является ценным методом, у нее есть ограничения. Поскольку она является высокочувствительной методикой, любая форма загрязнения (контаминации) образца даже следовыми количествами ДНК может приводить к ошибочным результатам. Кроме того, для разработки праймеров необходимы некоторые данные предварительной последовательности. Поэтому ПЦР можно использовать только для идентификации присутствия или отсутствия известного патогена или гена. Другое ограничение заключается в том, что праймеры, используемые для ПЦР, могут отжигать неспецифические последовательности, которые являются сходными, но не полностью идентичными ДНК-мишени. Кроме того, неправильные нуклеотиды могут быть включены в последовательность ДНК-полимеразой, хотя и с очень низкой скоростью.

Резюме

ПЦР представляет собой простой и широко используемый метод, при котором мелкие количества ДНК могут быть амплифицированы в большое количество копий. В дополнение к быстроте, с которой работает этот анализ, он способен количественно продемонстрировать, какая часть конкретной последовательности присутствует. Как и во всех методах, справедливость результатов следует сравнивать со спецификой, связанной с этим методом. Будущее ПЦР является многообещающим, сочетая различные анализы и подходы для лучшего понимания различных комбинаций генов. Например, в исследовании по связыванию отдельных таксонов в микробном сообществе с конкретными метаболическими процессами стабильное зондирование изотопов было объединено с qPCR. Эксперименты с микрочипом могут быть подтверждены подходом qPCR из-за его быстроты.

Купить Красную Нить на запястье в Москве http://Red-Thread.top/v-moskve/ Только положительные отзывы

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *