Криоконсервация имеет решающее значение для долгосрочного использования клеток в лаборатории, поэтому важно, чтобы вы знали как можно больше о процессе замораживания и оттаивания клеток.
Даже самый прилежный и преданный своему делу ученый не в состоянии поддерживать линию клеток изо дня в день в течение многих лет.
Кроме того, клетки могут претерпевать генетические изменения, стареть или, становиться загрязненными по мере увеличения продолжительности культивирования. Замораживание может защитить клетки от этих процессов.
Замораживание и оттаивание клеток можно легко осуществить с помощью всего лишь нескольких реагентов, а хранение клеток в жидком азоте обеспечит надежный их источник.
Здесь мы познакомим вас с особенностями замораживания и оттаивания ячеек.
Замораживание и оттаивание клеток
Как заморозить клетки
Необходимы специальные материалы:
- культивированные клетки
- среда для роста клеток
- растворы для отделения клеток от планшета при использовании адгезивных культур (например, сбалансированный солевой раствор, трипсин / ЭДТА)
- диметилсульфоксид (ДМСО) для тканевых культур
- фетальная бычья сыворотка (FBS)
- криопробирки
- камера для замораживания клеток
- Морозильная камера –80 ° C
- емкость с жидким азотом для длительного хранения.
1. Пассирование (разделение) клеток
Здоровые, активно растущие клетки следует использовать для криоконсервации. Я всегда стараюсь заморозить большое количество клеток, которые не подвергались пересеву в культуру слишком много раз.
Я пассирую клетки за 1-2 дня до замораживания, чтобы убедиться, что они находятся в логарифмической фазе роста во время замораживания.
Некоторые лаборатории рекомендуют менять питательную среду за 24 часа до замораживания, если в это время клетки еще не пассировали.
2. Подготовка клеток
Удалите клетки из чашки, следуя обычному методу пассирования прилипших или суспензионных культур. Объедините клетки в центрифуге
3. Ресуспендируйте клетки в замораживающей среде и поместите аликвоты в криопробирки.
Замораживание клеток может быть смертельным. Чтобы избежать повреждения, которое может быть вызвано, например, образованием кристаллов льда, осмотическим стрессом или повреждением мембраны, используется криопротектор для понижения точки замерзания клеток.
ДМСО в виде 10% основного раствора является наиболее часто используемым криопротектором.
Внимание: при работе с ДМСО надевайте перчатки, так как он легко проникает через кожу.
Наиболее распространенная среда для замораживания — 90% FBS / 10% DMSO. Для менее привередливых клеток и для культурной ткани с ограниченным бюджетом также можно использовать 10% ДМСО в среде для роста клеток.
После центрифугирования ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл замораживающей среды на криопробирку.
Убедитесь, что у вас есть криопробирки, предназначенные для хранения жидкого азота. Я обычно планирую 1 чашку клеток 100 мм на криопробирку. Виалы должны быть маркированы лабораторным маркером, устойчивым к воздействию алкоголя и жидкого азота .
При маркировке криопробирок обязательно указывайте номера проходов / партий.
4. Заморозить клетки
Чтобы вода могла выйти из клеток перед замораживанием, замораживайте клетки медленно. Это достигается с помощью камеры для замораживания клеток. Дорогие морозильные камеры периодически подают жидкий азот для контроля скорости замораживания.
Менее дорогие варианты включают камеры, в которых используется изопропанол комнатной температуры. В камеру помещают флаконы, добавляют изопропанол и помещают на –80 ° C как минимум на 4 часа.
Те из нас, у кого ограниченный бюджет, используют самодельные камеры. Я сохраняю штативы из пенополистирола, которые поставляются с пробирками на 15 мл, помещаю криопробирки в каждое отверстие, накрываю второй стойкой, склеиваю стойки и устанавливаю при –80 ° C.
5. Не забудьте переместить клетки в резервуар с жидким азотом
Вероятно, одна из самых сложных вещей в этом протоколе — не забыть переместить замороженные криопробирки в резервуар с жидким азотом. Я обычно оставляю клетки на ночь при –80 ° C, а затем быстро помещаю криопробирки в резервуар с жидким азотом.
Как разморозить клетки
Необходимы специальные материалы:
- замороженные клетки
- среда для роста клеток
- Водяная баня 37 ° C.
1. Извлеките клетки из резервуара и разморозьте.
Для максимальной жизнеспособности клеток важно медленно замораживать клетки. Обратное верно для оттаивания — оттаять быстро! Извлеките криопробирки из резервуара с жидким азотом и немедленно поместите их в водяную баню с температурой 37 ° C.
Держите криопробирки на водяной бане до тех пор, пока в криопробирке не останется кристаллов льда.
2. Перенос
Немедленно перенесите клетки в большой объем предварительно нагретой среды для роста клеток (аликвота клеток ~ 10 мл / 1 мл).
Существует две точки зрения о том, следует ли немедленно удалять криопротектор из клеток:
- В некоторых лабораториях клетки центрифугируют, а осадок клеток ресуспендируют в свежей среде для роста клеток перед помещением клеток в чашку для культивирования. Так я впервые научился оттаивать клетки.
- Однако некоторые данные предполагают, что клетки после оттаивания становятся чрезвычайно хрупкими и что центрифугирование может увеличить гибель клеток. Поэтому рекомендуется высеять клетки и заменить питательную среду позже.
Для прикрепившихся клеток вы можете изменить среду, как только клетки прикрепятся к чашке.
Я перешел на этот метод, и теперь я обычно беру свои клетки прямо перед тем, как покинуть лабораторию на ночь, и первым делом меняю среду на следующее утро.
3. Проверьте свои клетки.
Примерно через 24 часа после оттаивания я внимательно изучаю свои клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они здоровы и ведут себя нормально.
Резюме
Эффективное замораживание и размораживание клеток избавит вас от смущения, связанного с запросом у коллеги еще одной аликвоты их клеток, или от затрат на покупку новых клеток.
А если ничего не помогает, не забывайте медленно замораживать и быстро оттаивать!
Добавить комментарий