Разработка праймеров для qPCR — важный шаг при постановке анализа qPCR или обратной транскрипции-qPCR (RT-qPCR). Праймеры qPCR, которые плохо отжигаются или отжигаются более чем к одной последовательности во время амплификации, могут значительно повлиять на качество и надежность результатов.
Кроме того, если вы проводите одностадийную RT-qPCR, обратная транскриптаза будет использовать обратный праймер для запуска реакции транскрипции. В этом случае некачественный праймер приведет как к неэффективной обратной транскрипции, так и к неэффективной амплификации — проигрышная ситуация.
Учитывая вышесказанное, стоит потратить время, необходимое для разработки качественных праймеров для qPCR. В этой статье мы расскажем вам, как именно это сделать!
Хорошая новость заключается в том, что праймеры дешевы, поэтому вы можете легко протестировать несколько различных пар, чтобы выбрать лучшие для вашего эксперимента.
Плохая новость: тестирование праймеров требует времени и терпения, поэтому чем быстрее вы получите пару работающих праймеров, тем лучше.
Инструмент NCBI Primer-BLAST широко используется для дизайна праймеров для qPCR. В Интернете доступно множество других инструментов для проектирования праймеров, включая primer3, а поставщики ПЦР часто предлагают свои собственные бесплатные программы для проектирования.
Ниже описаны основные этапы проектирования праймеров для qPCR с использованием инструмента NCBI Primer-BLAST.
Этапы проектирования будут аналогичными, если вы используете другие программы проектирования праймеров, и приведенная ниже информация должна дать вам представление о параметрах, на которые следует обратить внимание.
Дизайн праймеров для qPCR: Начало работы
Зайдите в базу данных генов Pubmed и выполните поиск интересующего вас гена. В правом углу следующего экрана вы можете отфильтровать по видам.
Нажмите на интересующий вас ген и прокрутите страницу вниз, пока не найдете NCBI Reference Sequence (RefSeq) для вашего гена (например, «NM_203483»).
Нажмите здесь, и на следующем экране в правом углу экрана вы увидите ссылку «Pick primers».
Параметры праймеров для qPCR
Установите следующие параметры праймеров:
Размер продукта ПЦР/ампликона: Для эффективной амплификации подберите праймеры таким образом, чтобы длина ампликона составляла от 70 до 200 п.н.
Количество праймеров для возврата: Это зависит от вас, в зависимости от того, сколько вариантов вы хотите выбрать. Программе не потребуется много времени, чтобы разработать 10 пар праймеров, и это должно дать вам разумный шанс найти подходящую пару.
Температура плавления: Как правило, следует стремиться к минимальной температуре 60°C и максимальной 63°C; идеальная температура плавления составляет 60°C (с максимальной разницей в 3°C в температурах плавления, Tm, двух праймеров). Для определения этих температур можно использовать калькулятор Tm.
Выбор экзона/интрона
Чтобы избежать амплификации загрязняющей геномной ДНК, подберите праймеры таким образом, чтобы одна половина праймера гибридизовалась с 3′-концом одного экзона, а другая половина — с 5′-концом соседнего экзона.
Для этого просто выберите «Праймер должен охватывать стык экзона и экзона». Другие параметры изменять не нужно.
Параметры проверки специфичности пары праймеров: Используйте настройки по умолчанию. Программа будет использовать последовательность RefSeq мРНК выбранного вами организма для конструирования праймеров.
Проверка экрана вывода
Посмотрите на параметры, которые выдала программа, и обратите особое внимание на следующее:
Убедитесь, что 3′-конец праймера содержит остаток C или G, поскольку остатки T и A легче связываются с ДНК неспецифическим образом.
Стремитесь к содержанию GC около 40-60% для обеспечения максимальной стабильности продукта.
Избегайте самокомплементарности, чтобы снизить вероятность образования праймер-димеров. В идеале праймер должен иметь почти случайный набор нуклеотидов.
Теперь выберите два-три лучших праймера и протестируйте их. Удачи!
Если у вас есть другие лучшие советы по разработке праймеров для qPCR, мы будем рады услышать вас в комментариях!
Добавить комментарий