Если вы работаете в быстро развивающейся и захватывающей дисциплине синтетической биологии, то, скорее всего, вы знаете все о синтетических аминокислотах. Если вы не знакомы с ними, мы расскажем вам о том, что они становятся мощным инструментом в синтетической биологии и белковой инженерии. В синтетической биологии используется расширенный генетический код, который выходит за рамки 20 кодонов естественных аминокислот и назначает новые кодоны. Зачем нам это нужно, спросите вы? Ну, исследователи используют синтетическую биологию для борьбы с болезнями, разработки новых лекарств, улучшения окружающей среды и поиска новых источников пищи.
Например, синтетическая аминокислота p-ацетилфенилаланин была включена в антитело, чтобы обеспечить конъюгацию с небольшой молекулой, которая связывается с антигеном на клетках простаты. Сконструированное антитело действует как мост, соединяющий цитотоксические Т-клетки с опухолевой клеткой, позволяя Т-клетке вступить в контакт и уничтожить раковую клетку. Аминокислота в данном случае была ключом к эффективному созданию этого специального антитела, что было бы очень трудно, если вообще возможно, сделать с естественным белком.
Синтетические аминокислоты также могут быть включены в пептиды и белки, полученные искусственным путем.
В этой статье мы рассмотрим, что такое синтетические аминокислоты и как они используются, чтобы вы быстро освоились!
В двух словах, синтетические аминокислоты — это непротеиногенные аминокислоты, то есть они не входят в число 20 аминокислот, которые прикрепляются к тРНК в живых клетках и используются для полимеризации белков. Некоторые встречаются в природе, но большинство из них синтезированы химическим путем.
Цитруллин — хороший пример непротеиногенной аминокислоты, образующейся в естественных условиях в результате окисления аргинина, а п-бензоил-фенилаланин — пример аминокислоты, вообще не встречающейся в природе.
Некоторые искусственные аминокислоты получены из 20 встречающихся в природе разновидностей, но изменены с помощью химических модификаций. Мы обобщили различные типы неестественных аминокислот в таблице 1.
| Тип модификации | Модификация |
|---|---|
| Непротеиногенная (например, цитруллин) | Не существует природного кодона; обычно производится in vivo путем посттрансляционной модификации природной аминокислоты |
| Бета-аминокислоты | Добавление второго углерода между аминогруппой и карбоксигруппой |
| Гомо-аминокислоты | Добавление метиленовой группы между альфа-углеродом и боковой группой |
| Бета-гомо-аминокислоты | Добавление второго углерода между амино- и карбоксигруппами и добавление метиленовой группы между альфа-углеродом и боковой группой |
| Модифицированная боковая группа (например, п-бензоил-фенилаланин) | Модификация встречающейся в природе боковой группы для придания ей дополнительной функциональности |
| N-метил-аминокислоты | Присоединение метильной группы к азоту в аминогруппе |
| Альфа-метил-аминокислоты | Метильная группа заменяет водород на альфа-углероде |
| D-аминокислоты | Хиральность на альфа-углероде в конфигурации D, а не L, как в аминокислотах природного происхождения |
Как используются синтетические аминокислоты?
Области применения искусственных аминокислот столь же разнообразны, как и решаемые научные проблемы. Тем не менее, большинство из них связано с белковой инженерией, где синтетические аминокислоты используются для изучения или улучшения функции белка или для создания биологически активных пептидов, обладающих терапевтическим действием.
Давайте рассмотрим некоторые примеры использования искусственных аминокислот.
Фотосшивка
p-бензоил-фенилаланин используется для изучения взаимодействий белок-белок и белок-нуклеиновая кислота путем воздействия ультрафиолетового света. Это вызывает реакцию с инактивированными C-H связями. Создавая эту ковалентную связь, вы можете поймать белки или пептиды в действии!
Фотоактивация
Использование света с определенной длиной волны с фотоактивированными аминокислотами может включить белок. Фотоактивируемая аминокислота может содержать группу, такую как 4,5-диметокси-2-нитробензил (DMNB), присоединенную, например, к боковой цепи серина. При воздействии света группа DMNB расщепляется, обнажая естественную группу -OH, которая затем может быть фосфорилирована. Вы можете сконструировать белок так, чтобы он был «выключен», введя фотоактивированную аминокислоту в критический остаток в активном сайте фермента; затем вы можете устранить ингибирование, подвергнув белок воздействию света и посмотрев, что произойдет, когда вы включите белок.
Флуоресцентное мечение
Сюда входит анализ FRET. Пометка белков и пептидов флуоресцентными красителями хорошо известна. Помеченные несколькими флуоресцентными группами, вы можете измерять сворачивание и взаимодействие с помощью FRET или просто визуализировать это in vivo. Например, можно визуализировать связывание флуоресцирующего пептидного лиганда с рецептором на поверхности клетки.
Белковая инженерия
Одним из важных применений неестественных аминокислот является замена естественной аминокислоты в бета-лактамазе на p-акриламидо-фенилаланин. Это увеличивает активность белка в несколько раз. Другие искусственные аминокислоты обеспечивают повышенную стабильность. Например, замена тирозина в лизоциме Т4 на м-хлоротирозин повышает стабильность и ферментативную активность при более высоких температурах.
Медицинская химия
Синтетические аминокислоты могут быть использованы в качестве строительных блоков для более сложных молекул. Они могут быть включены в пептидомиметические (соединения, имитирующие пептиды или белки) препараты или использоваться непосредственно в качестве терапевтических средств.
Существует множество применений для искусственных аминокислот и довольно много способов включить их в пептиды и белки. Стоит обратить внимание на SwissSidechain, базу данных Швейцарского института биоинформатики, которая может быть использована для моделирования вставки сотен боковых цепей синтетических аминокислот в пептиды in silico.
Как включить синтетические аминокислоты в белки и пептиды
Итак, теперь вы знаете, как можно использовать синтетические аминокислоты, но как их ввести в белок или пептид?
Существует несколько подходов: один из них заключается в синтезе пептида с использованием искусственной аминокислоты. Другие подходы основаны на создании системы трансляции in vivo или in vitro в бесклеточных условиях.
Рассмотрим первый подход — химический синтез. Синтетические аминокислоты могут быть встроены в пептиды практически так же, как и их природные аналоги, путем блокирования реактивных групп и присоединения карбоксигруппы к аминогруппе соседней аминокислоты.
Когда речь идет об использовании трансляционного механизма, существует два метода — селективное включение под давлением (SPI) и подавление стоп-кодона (SCS). Давайте рассмотрим их более подробно.
Селективное включение под давлением (SPI)
Для SPI требуется вспомогательный штамм бактерий, выращенный на среде с добавлением искусственной аминокислоты, структурно схожей с натуральной аминокислотой, которую организм не может производить.
Хотя это не так эффективно, вспомогательный штамм можно убедить использовать синтетическую аминокислоту вместо ее естественного аналога. Например, допустим, ауксотроф должен культивироваться на среде с добавлением тирозина.
Если добавить в среду искусственную аминокислоту, структурно сходную с тирозином, организм зарядит тРНК тирозина структурно сходной неестественной аминокислотой и включит неестественную аминокислоту в белок.
Подавление стоп-кодона (SCS)
Подавление стоп-кодона (SCS) направляет трансляционную систему клетки-хозяина на распознавание одного из трех стоп-кодонов (обычно янтарного кодона, UAG) как кодона, соответствующего неестественной аминокислоте. Для работы SCS необходима ортогональная система трансляции, которая не будет «перекрещиваться» с эндогенной системой трансляции.
Например, метаногенная архея, известная как Methanosarcina barkeri, производит очень уникальную тРНК (tRNAPyl) с антикодоном, комплементарным кодону UAG. M. barkeri также производит тРНК-синтетазу (PylRS), которая заряжает тРНКAPyl синтетической аминокислотой, известной как пиролизин.
Если бы вы ввели гены M. barkeri, кодирующие эти гены, в нативный штамм, такой как E. coli, механизм трансляции в этом теперь уже модифицированном штамме E. coli прочитал бы кодон UAG и включил бы пиролизин в это положение, вместо того чтобы прекратить трансляцию. PylRS не заряжает ни одну из нативных тРНК E. coli пиролизином или другими аминокислотами, равно как и нативные тРНК-синтетазы E. coli не заряжают тРНК никакими другими аминокислотами. Другими словами, перекрестного взаимодействия не происходит.
Пиролизиновая тРНК-синтетаза M. barkeri может заряжать тРНК-апил и другими производными лизина, кроме пиролизина, а исследователи использовали мутанты PylRS для заряжения тРНК-апила производными фенилаланина. Эта система синтетической биологии была использована для получения нативных белков, модифицированных десятками неестественных аминокислот in vivo. [12]
Добавить комментарий