Осаждение этанолом — широко используемый метод концентрирования и обессоливания препаратов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в водном растворе.
Основная процедура заключается в добавлении соли и этанола в водный раствор, что заставляет нуклеиновые кислоты (НК) выпадать в осадок. После осаждения НК могут быть отделены от остальной части раствора путем центрифугирования. Затем гранула промывается в холодном 70% этаноле. После следующей ступени центрифугирования этанол удаляется, а таблетка нуклеиновой кислоты высыхает перед повторным суспендированием в чистом водном буфере.
Так как это работает?
Все дело в растворимости…
Во-первых, нам нужно знать, почему нуклеиновые кислоты растворимы в воде. Вода — полярная молекула — имеет частичный отрицательный заряд вблизи атома кислорода за счет неразделенных пар электронов, и частичный положительный заряд вблизи атомов водорода. Благодаря этим зарядам полярные молекулы, такие как ДНК или РНК, могут электростатически взаимодействовать с молекулами воды, позволяя им легко растворяться в воде. Полярные молекулы, таким образом, можно описать как гидрофильные и неполярные молекулы, которые не могут легко взаимодействовать с молекулами воды, являются гидрофобными. Нуклеиновые кислоты являются гидрофильными из-за отрицательно заряженных фосфатных групп (PO3-) вдоль сахарно-фосфатной основы.
Роль соли
Ладно, вернемся к протоколу. Роль соли в протоколе — нейтрализовать заряды на сахарно-фосфатной основе. Часто используемая соль — это ацетат натрия. В растворе ацетат натрия гидролизуется на Na+ и [CH3COO] -. Положительно заряженные ионы натрия нейтрализуют отрицательный заряд на PO3-группах нуклеиновых кислот, делая молекулу гораздо менее гидрофильной и, следовательно, гораздо менее растворимой в воде.
Роль этанола
Электростатическое притяжение между ионами Na+ в растворе и ионами PO3- продиктовано кулоновским законом, на который влияет диэлектрическая постоянная раствора. Вода имеет высокую диэлектрическую проницаемость, что затрудняет сближение ионов Na+ и PO3-. Этанол, с другой стороны, имеет гораздо более низкую диэлектрическую проницаемость, что значительно облегчает взаимодействие Na+ с PO3-. Это защищает его заряд и делает нуклеиновую кислоту менее гидрофильной, заставляя ее выпадать из раствора.
Роль температуры…
Инкубация смеси нуклеиновой кислоты с солью/этанолом при низких температурах (например, -20° или -80°C) обычно упоминается в качестве необходимого шага в протоколах. Однако, утверждается, что в этом нет необходимости, так как нуклеиновые кислоты в концентрациях до 20 нг/мл выпадут в осадок при 0-4°C, поэтому достаточно инкубации на льду в течение 15-30 минут.
Шаг промывки с 70% этанолом…
Этот шаг состоит в том, чтобы смыть остатки соли с гранулированной ДНК.
Несколько советов по осаждению этанолом…
Выбор соли
- Используйте ацетат натрия (0.3 M final conc, pH 5.2) для обычного осаждения ДНК.
- Для образцов ДНК, содержащих SDS, используйте хлорид натрия (0,2 M final conc), так как NaCl сохраняет SDS растворимым в 70% этаноле, чтобы не выпадать в осадок с ДНК.
- Используйте хлорид лития (0,8 M final conc) для РНК. Поскольку для осаждения РНК требуется 2,5-3 объема этанола, а LiCl более растворим в этаноле, чем ацетат натрия, он не выпадает в осадок. Но будьте осторожны — хлорид-ионы будут подавлять синтез белков и полимеразу ДНК, поэтому LiCl не подходит для РНК-рецептов для трансляции in vitro или обратной транскрипции. В этих случаях используйте ацетат натрия.
- Используйте ацетат аммония (2 M final conc) для удаления ДНТП, но не используйте его для подготовки ДНК к Т4 полинуклеотидным киназным реакциям, так как ионы аммония ингибируют фермент.
Для увеличения выхода в осаждениях низкой концентрации или небольших последовательностей нуклеиновой кислоты (менее 100 нуклеотидов).
- Добавьте MgCl2 до конечной концентрации 0,01 M.
- Увеличить время инкубации на льду до центрифугирования до 1 часа.
Добавить комментарий