Почему люди по-разному реагируют на лекарства или события? Ответ на этот вопрос является решающим шагом в процессе разработки лекарства или вакцины, и одним из вопросов, с которого следует начать, является определение того, играет ли роль дифференциальная экспрессия генов.
Исторически сложилось так, что если бы вы хотели изучить экспрессию генов, вы бы использовали qPCR. Но этот подход ограничивает количество генов, которые вы можете исследовать, и требует предварительного знания последовательностей генов, что означает, что идентификация и профилирование новых генов не представляется возможным.
Одним из решений является использование секвенирования следующего поколения (NGS), которое может способствовать повышению пропускной способности. NGS позволяет осуществить открытие экспрессии генов без предварительных предположений в широком диапазоне параметров и определить конкретные гены, реагирующие на определенный стимул, например, противораковое лекарство.
Полнотранскриптомное секвенирование РНК обеспечивает базовое разрешение пар для каждого транскрипта, что может быть полезно при изучении мутаций или вариантов сплайсинга. Однако, если целью вашего исследования является измерение уровней экспрессии генов, то использование РНК по всей транскриптомной схеме даст вам гораздо больше данных, чем вам необходимо. Избыток данных означает потратить больше денег и времени на проведение экспериментов и анализ данных, чем требуется.
Если вы ищете NGS метод для профилирования экспрессии генов, который не повредит вашему бюджету, рассмотрите 3′ mRNA-Seq. Этот метод может похвастаться чувствительным обнаружением экспрессии генов, более простым анализом данных и может обеспечить экономию средств по сравнению с секвенированием РНК по всей транскриптоме.
Сравнение методов анализа экспрессии генов
Чтобы понять, чем 3′ mRNA-Seq отличается от других NGS методов анализа экспрессии генов, сравним их рабочие процессы и результаты.
Полное транскриптомное секвенирование РНК для профилирования экспрессии
Полнотранскриптомное секвенирование РНК позволяет обнаруживать неизвестные транскрипты и изучать кодирующие и некодирующие гены одновременно. Полнотранскриптомное секвенирование РНК позволяет выявить ранее неизвестные цели и эффекты лекарств и выявить лица, которые будут по-разному реагировать на конкретное лечение. Такие комплекты, как набор InvitrogenTM CollibriTM Stranded RNA-Seq для систем Illumina, делают эту задачу относительно простой. Рабочий процесс включает в себя:
- Захват мРНК с помощью магнитных олиго-дТ-бусин.
- Фрагментация мРНК
- Добавление вспомогательных адаптеров к РНК, образующих полноразмерные адаптеры секвенирования для систем Illumina во время ПЦР
- Генерация двухцепочечной кДНК
- Расширение библиотеки
- Количественный анализ библиотеки
- Секвенирование.
Вы можете измерить дифференциальную экспрессию генов, сравнивая данные о количестве прочитанных данных различных экспериментальных групп. Например, образец, обработанный препаратом, по сравнению с контролем. Результаты дифференциальной экспрессии генов при секвенировании целых транскриптомов хорошо согласуются с данными qPCR и демонстрируют высокий уровень воспроизводимости между реплицируемыми образцами.
Одним из предостережений при таком подходе является то, что он требует большего количества считываний на одну выборку по сравнению с секвенированием 3′ мРНК, а значит, более сложен для проведения анализа данных и требует более значительных инвестиций в химию секвенирования.
3′ mRNA-Seq: более простая альтернатива для экспрессионного профилирования NGS
3′ mRNA-Seq также предоставляет возможность изучать уровни экспрессии многих генов одновременно и без предварительного знания последовательности генов. Как и традиционный подход mRNA-Seq, он также имеет высокий уровень воспроизводимости между реплицируемыми образцами и хорошо соответствует данным qPCR.
Преимущества 3′ mRNA-Seq
Метод 3′ mRNA-Seq аналогичен традиционному подходу mRNA-Seq, но имеет некоторые ключевые отличия.
- Обратная транскрипция происходит только на 3′ полиА хвосте мРНК с использованием олиго dT праймера.
- МРНК деградирует до синтеза второго звена.
Эти различия означают, что 3′ мРНК-Seq не страдает от того же вопроса смещения в сторону более длинных транскриптов, что и последовательность целых транскриптомов, поскольку она генерирует только один фрагмент на транскрипт. Генерация только одного фрагмента на транскрипт также упрощает анализ данных, поскольку нет необходимости подстраиваться под длину транскрипта.
Использование 3′ mRNA-Seq в генэкспрессионном анализе.
Если вы не уверены в тестировании этой новой технологии, будьте уверены, что 3′ mRNA-Seq уже используется для широкого круга исследовательских интересов и в различных тканях и экспериментальных условиях.
Используя 3′ mRNA-Seq, австрийские ученые исследовали пути, связанные с иммуноэдитингом при раке. Они сравнили ответ диких и иммунодефицитных мышей на инъекции клеток аденокарциномы толстой кишки MC38. Затем они смогли выделить несколько генов, связанных с механизмом иммунной защиты, запускаемым опухолью, что позволило нам лучше понять пути, по которым проходит этот жизненный процесс.
Гастроэнтерология — это еще одна область, в которой уже используется технология 3′ mRNA-Seq. Исследователи в Германии используют ее для изучения влияния биома кишечника мыши на ответную реакцию воспаления. Сравнение бесклеточных и здоровых мышей, колонизированных с беспатогенной микробиотой, позволило выявить у бесклеточных мышей дифференциально экспрессированные гены, связанные с макрофаговой биологией.
3′ mRNA-Seq также имеет коммерческое применение, при этом исследователи в Таиланде используют его для изучения метаболического ответа в почвенном грибке Aspergillus terreus. Этот грибок вырабатывает итаконовую кислоту — важный химикат, используемый во многих промышленных процессах. В условиях повышенной выработки итаконовой кислоты исследователями были выявлены законсервированные гены. Выявление этих генов помогло прояснить путь, по которому A. terreus образует итаконовую кислоту, и предложило потенциальные будущие цели генного редактирования для оптимизации производства.
Суммируя преимущества 3′ mRNA-Seq
3′ mRNA-Seq уже используется для изучения дифференциальной экспрессии генов в различных тканях и видах и позволило исследователям выявить новые компоненты путей в ряде процессов. Эта методика углубляет наши знания по целому ряду тем, начиная с вопросов здравоохранения, включая рак и IBS, и заканчивая коммерческими интересами, такими как оптимизация производства коммерчески ценных биопродуктов.
Когда речь заходит о выявлении дифференциальной экспрессии неизвестных генов, 3′ mRNA-Seq экономически эффективна, проста в анализе и воспроизводима так же, как и секвенирование целых транскриптомов. Химия секвенирования не требует дополнительных затрат для получения большего количества считываний, и метод совместим со всеми NGS-системами Illumina.
Добавить комментарий