Как правило, никто не задумывается о том, как поверхности лабораторного оборудования (например, микроцентрифужные пробирки, планшеты, чашки петри и др.) могут повлиять на результаты экспериментов. Вы всегда должны понимать, когда нам нужно использовать стекло вместо пластика. Или знать, что определенные химические вещества, такие как хлороформ, будут взаимодействовать с некоторыми пластиковыми полимерами, и вы должны использовать полимеры, которые более устойчивы к плавлению, такие как полипропилен. Однако понимание того, как поверхность используемых материалов взаимодействует с растворами во время эксперимента, очень важно, особенно при работе с белками в растворе.
Белки обладают способностью неспецифически адсорбироваться или прилипать к рабочей поверхности, такой как канал, чип, контейнер или наконечник пипетки. Белковая адгезия зависит от структуры белков. Они содержат как гидрофобные, так и гидрофильные области, которые притягивают подобные поверхности. Таким образом, сильно гидрофобная или гидрофильная поверхность является идеальным виновником адгезии белка.
Белковая адгезия настолько распространена, что целый ряд исследований посвящен изучению ее возникновению и минимизации. Белковая адгезия имеет место всякий раз, когда белок вступает в контакт с гидрофобной поверхностью (например, пластмассы и полимеры) или гидрофильной поверхностью (например, стекло). Если принять во внимание количество экспериментов, в которых используются стекло, пластмассы и полимеры на основе пластика, вы можете легко увидеть, как часто в лаборатории происходит адгезия белка.
Как адгезия белка влияет на ваши эксперименты
Является ли повсеместное распространение белковой адгезии поводом для беспокойства? Как это может повлиять на ваши эксперименты? Вот несколько примеров такого влияния:
Концентрация
Адгезия напрямую влияет на измерение концентрации целевого белка. Неизвестно, какая часть растворенного белка, прилипшего к стеклянной или пластиковой поверхности, изменит конечную концентрацию. Это приводит к потере важных молекул и неправильным показаниям концентрации. Также трудно удалить прилипшие белки, что затрудняет определение того, сколько белка было потеряно.
Структура белка
Другая проблема заключается в том, что при связывании с различными поверхностями белки могут изменить свою форму, чтобы принять более термодинамически благоприятную конформацию. Например, белок может изменить морфологию, чтобы увеличить площадь взаимодействия гидрофильных участков с гидрофильной поверхностью. Как мы знаем, структура влияет на функцию и наоборот. Таким образом, это изменение конформации может изменить биологическую активность адсорбированного белка в растворе, что, в свою очередь, может повлиять на эксперименты по измерению реактивности белка. Аналогичным образом, изменение конформации белка вследствие адсорбции может привести к изменению сродства олигомера или лиганда между белками-мишенями, влияя на наблюдаемые результаты.
Засорение канала
Одним из эффектов адгезии белка, который имеет технические последствия, является то, что он может засорить каналы. Устройства, которые используются повторно, могут удерживать частицы белка, ранее адсорбированные, загрязняя будущие эксперименты. В биомедицинской промышленности эту важную проблему называют биообрастанием.
Что вы можете сделать с адгезией белка
Минимизация адгезии белка жизненно важна для предотвращения вышеупомянутых сценариев, влияющих на ваши эксперименты. Однако, прежде чем адгезия белка может быть сведена к минимуму, она сначала должна быть обнаружена. Хотя может быть трудно отделить прилипшие белки, вы можете определить, на каких этапах происходит адгезия белка. Вы можете анализировать образец в несколько этапов во время протокола, чтобы обнаружить и количественно определить любое уменьшение размера или концентрации.
Монитор адгезии белка
Одним из способов контроля адгезии белка является использование подхода, который является высокочувствительным при обнаружении белков, такого как микрофлюидный диффузионный анализ (MDS), используемый на платформе Fluidity One. Отличительной чертой микрофлюидики является то, что она позволяет манипулировать крошечными объемами жидкости.
Используя MDS, очень небольшая часть образца может быть использована для измерения концентрации и размера очищенного белка. На платформе Fluidity One количественное определение белка достигается с помощью латентного флуорогенного красителя, который флуоресцирует при взаимодействии с первичными аминами белка. Эта реакция завершается, а это означает, что флуоресценция может использоваться для измерения концентрации белка напрямую, без сравнения со стандартом. Концентрации можно затем определить количественно на разных этапах в ходе эксперимента, указав, был ли образец потерян из-за адгезии белка, на каких этапах эксперимента он произошел и количество потерянного белка. Изменения размера также можно отслеживать с помощью MDS, указывая, есть ли конформационные изменения в белке, представляющем интерес.
Общая склонность белка к адгезии также может быть оценена с использованием MDS. Прибор сообщает о степени адгезии образца, наблюдаемой во время анализа, поэтому его можно легко сравнить по образцам.
Одноразовые микрожидкостные чипы, такие как те, которые используются с Fluidity One, обрабатывают гидрофильным покрытием для минимизации адгезии, но даже в этом случае чувствительность такова, что адгезия может наблюдаться, как описано.
Как только адгезия будет распознана, вы можете предпринять некоторые шаги, чтобы минимизировать адгезию белка.
Минимизация адгезии белка
При разработке ваших экспериментов, обратите особое внимание на материалы лабораторного оборудования. Свойство материала поверхности будет диктовать, что вы можете сделать, чтобы уменьшить адгезию. Например, прикрепляя полиэтиленгликоли (ПЭГ) к гидрофильным поверхностям, таким как стекло, вы уменьшаете гидрофильность поверхности, что может минимизировать адгезию белка. Для гидрофобных поверхностей, таких как пластмассы и гидрофобные полимеры, добавление небольшого количества мягкого моющего средства, такого как Triton X, может уменьшить адсорбцию белков. Что делать, если вы не можете использовать эти методы с вашим белком? Существуют и другие способы минимизации адгезии белка, включая использование солей и бычьего сывороточного белка.
Выявление и количественная оценка адгезии белка для получения воспроизводимых результатов
При работе с образцами белка важно учитывать адгезию при рассмотрении факторов, которые могут повлиять на ваши результаты. Хотя белковая адгезия является распространенным явлением, существуют инструменты, позволяющие обнаружить и минимизировать это потенциально разрушительное явление. Решение может быть таким же простым, как изменение материалов вашего лабораторного оборудования. Решение проблемы адгезии белка улучшит точность и воспроизводимость ваших исследований.
Добавить комментарий