Что такое синтетические пептиды?
Синтетические пептиды — это химически синтезированные мелкие полимеры аминокислот. Можно считать, что синтетические пептиды являются для белков тем же, что и олигонуклеотиды для ДНК. Химия, используемая для синтеза пептидной связи между двумя аминокислотами, известна уже 100 лет, а первые мелкие белки были химически синтезированы в 1950-х и 1960-х годах.
Вкратце, реакция синтеза заключается в присоединении карбоксильной группы аминокислоты к аминогруппе предыдущей аминокислоты в пептидной цепи. Различные реактивные группы на боковых цепях и термини должны быть химически защищены, чтобы предотвратить возникновение нежелательных реакций.
Теперь пептиды легко синтезируются в очень больших масштабах, и вы можете просто оформить заказ онлайн и получить его через несколько дней! В этой статье мы рассмотрим применение синтетических пептидов, а также их преимущества и недостатки.
Синтетические пептиды против рекомбинантных белков
Возможно ли синтезировать целый белок? Предельный размер синтетических пептидов составляет около 20 — 50 аминокислот, что является размером некоторых натуральных полипептидов, таких как цепи инсулина А и В.
Вы также можете связать синтетические пептиды посредством химического легирования для химического синтеза более крупных белков. Собрав и соединив частично защищенные пептиды, Нишиучи и др. синтезировали 238-остаточный прекурсор зеленого флуоресцентного белка (GFP) и установили, что профиль флуоресценции в растворе идентичен профилю флуоресценции рекомбинантного GFP. Но более подробно об этом мы поговорим во второй части. Пока запомним, что химически синтезировать целый белок можно, но это довольно сложно и не всегда выгодно.
Стоит упомянуть о системах in vitro translation systems (IVT). Здесь вы используете экстракты сырых клеток (обычно зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика) вместе с мРНК, аминокислотами и солями для создания пептидов в пробирке, а не в живых клетках. IVT обеспечивает преимущества использования биологических компонентов для создания полипептидов без необходимости беспокоиться о выращивании клеток. Этот подход идеально подходит для производства белков, которые могут быть токсичными для клетки-хозяина. Для некоторых небольших приложений, где необходимо быстро сделать пептид, превышающий 100 аминокислот, IVT может быть наилучшим вариантом.
Так зачем же использовать синтетический пептид поверх рекомбинантного или генерируемого IVT белка?
Зачем использовать синтетические пептиды?
С одной стороны, их можно сделать быстро, и вам не придется беспокоиться о системах клеточных культур или последующей очистке, как это было бы с рекомбинантными белками. Если вам нужно посмотреть на мотив связывания SH3 или на многие из них, вы можете получить тонну синтеза очень быстро.
Во-вторых, можно выделить различные элементы белков, такие как сайты связывания или киназовые субстраты. При полноразмерных белках наличие дополнительных факторов, доменов или мотивов может направить эксперимент в неверное русло. Однако, если взаимодействие не является простым, то пептиды могут оказаться недолговечными.
И в-третьих, учитывая простоту изготовления синтетических пептидов в больших количествах, можно легко провести высокопроизводительные эксперименты, например, измерить кинетику связывания или посмотреть на библиотеки пептидов. Очищенные белки требуют большого количества препарата, чтобы получить достаточное количество материала для измерения кинетики, и Вы ограничены по объему горсткой белковых аналитов за один раз.
Плюсы и минусы синтетических пептидов
Вот некоторые плюсы и минусы синтетических пептидов:
Плюсы
- Может быть рентабельным: Для приложений, которые требуют только пептид длиной 20-50 аминокислот, химический синтез — это путь к успеху. Есть поставщики, которые могут сделать это за вас быстро. Только экономия времени по сравнению с клонированием гена и экспрессией в клеточной системе того стоит.
- Может включать некоторые посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование Tyr или Ser.
- Высокая чистота и точность: Вы точно контролируете состав пептида и не беспокоитесь о сложности биологического матрикса. Кроме того, Вам не нужно добавлять метку сродства для очистки, которая может повлиять на естественную функцию пептида.
Минусы
- Ограниченный размер, который вы можете создать (20-50 аминокислот).
- Может быть проблематичным для взаимодействий, требующих посттрансляционных модификаций, которые трудно синтетически включить, таких как гликозилирование, для биологической активности.
- Сложно создать дисульфидные связи.
- Может не подходить для применения в тех случаях, когда вторичная или третичная структура является критической, или для создания более крупных биологически активных белков.
Использование синтетических пептидов
Генерирование пользовательских антител
Синтетические пептиды могут быть использованы в качестве антигенов для генерации пользовательских антител. При соединении с белком-носителем, пептид может стимулировать гуморальный иммунный ответ хозяина и генерировать как моноклональные, так и поликлональные антитела. Этот подход позволяет контролировать эпитоп намного легче, чем при использовании всего нативного белка. Однако аминокислотная последовательность антигена является критической. Несмотря на то, что это неточная наука, существуют бесплатные онлайн-инструменты (Напирмер база данных Пептид-Антиген), с помощью которых можно выбрать последовательность, которая с наибольшей вероятностью вызовет иммунный ответ.
Пептидные антитела идеально подходят для использования в вестерн-блотах. Если вы включаете фосфорилированную аминокислоту в пептиде, то вы смогли произвести антитело которое специфически обнаруживает фосфорилированный протеин. Пара это с антителом поднятым против такого же пептида содержа не фосфорилированный остаток, и Вы можете испортить ваш Вестерн-блот как для фосфорилированных, так и для не фосфорилированных форм протеина. Этот подход широко используется в работе с клеточной сигнализацией, где Вы заинтересованы в зондировании взаимодействия киназы и фосфатазы белка. И Вам не придется беспокоиться об очистке P-32!
Белок-белковые взаимодействия
В целом, синтетические пептиды отлично подходят для разрешения основных элементов белково-белкового взаимодействия. Биотинилированные пептиды могут быть иммобилизованы на бусинах, соединенных стрептавидином, и использованы для стягивания белков, взаимодействующих с пептидом. Это используется в эпигенетических исследованиях, где пептиды, соответствующие гистоновым хвостам с посттрансляционными модификациями и без них, инкубируются с ядерными экстрактами. Ассоциированные белки могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE.
Синтетические пептиды также идеально подходят для таких методов, как ЯМР-спектрометрия или флуоресцентная анизотропия, где меньший размер является ключевым моментом. Наконец, еще одно применение пептидов — в качестве подложек для ферментативных реакций. Сигуяма и др. (2019) использовали пептидные библиотеки и очищенные киназы для идентификации подложек прямой киназы. Это было бы очень трудно, если вообще возможно, использовать клеточные системы и искать взаимодействия нативных или рекомбинантных белков.
Масс-спектрометрия
Синтетические пептиды могут быть использованы в качестве стандартов в масс-спектрометрии для помощи в количественном определении и идентификации. Когда белок усваивается и анализируется по масс-спектрометру, может быть очень сложно количественно определить результирующие пептиды, так как пик масс-спектрометра зависит от химического состава пептидов в дополнение к их концентрации.
Например, если Вы заинтересованы в количественном определении уровня определенной пост-трансляционной модификации Вашего белка, Вы можете вколоть пептид с изотопной маркировкой этой модификации в известной концентрации. Теперь у вас есть внутренний стандарт, который позволяет вам количественно определить уровни нативного пептида.
Синтетические пептиды с изотопной маркировкой также могут помочь Вам идентифицировать пики в МС/МС спектре, так как они будут производить идентичные картины в МС/МС спектре, как и нативные пептиды, просто компенсируя разницу в молекулярном весе, основанную на используемых изотопах.
ELIspot
Одним из дополнительных применений синтетических пептидов, которое является актуальным для текущих событий, является анализ иммуносорбентного пятна, связанного с ферментом (ELISPOT), который в настоящее время используется довольно часто для проверки реакции хозяев на вакцины против SARS-CoV-2. Т-клетки собираются у пациентов и оспариваются в культуре с помощью пептидов, соответствующих белкам SARS-CoV-2, используемым в вакцине. Если культивированные клетки высвобождают интерферон-гамму (IFN-\gammaγ), это говорит о том, что вакцина может стимулировать клеточный иммунитет у пациента. Способность вырабатывать специфические пептиды позволяет точно дозировать антиген.
У вас есть опыт производства или использования синтетических пептидов? Оставьте комментарий ниже. Также следите за выходом второй части, где мы обсудим, как создавать пептиды и использовать неродные аминокислоты.
Добавить комментарий