Электрофорез — один из простейших, но наиболее чувствительных аналитических инструментов, используемых для разделения белков, нуклеиновых кислот и других биологических молекул в растворах проб. Однако, знаете ли вы, что существует около восьми типов электрофореза, и что каждый из этих методов может дать уникальную и ценную информацию о целевом белке? Если Вы хотите узнать больше об этих различных типах электрофоретических протоколов, то давайте начнем!
Основные типы электрофореза
Рутинный электрофорез
Традиционная и наиболее широко используемая клиническая лабораторная техника для разделения белков и нуклеиновых кислот. Эта техника обычно выполняется на гель-планке прямоугольной формы и также называется «зональным электрофорезом», так как она может вместить несколько образцов и контролировать их на одном геле, а также может быть использована для разделения растворов за один прогон. Он также может использоваться для разделения белков мочи и CSF, изоферментов, липопротеинов и гемоглобина.
Электрофорез высокого разрешения
Электрофорез высокого разрешения (HRE) — это всего лишь обычный электрофорез с использованием высокого напряжения. Этот метод, как правило, настоятельно рекомендуется, если требуется более высокое разрешение белков (например, выделение белков CSF для выявления рассеянного склероза, выделение световых цепей в моче для раннего выявления рассеянной миеломы и т.д.). Поскольку повышение напряжения также увеличивает выделяемое тепло, HRE включает в себя охлаждающее оборудование для предотвращения денатурации белков и высыхания геля и других компонентов.
Полиакриламид (PAGE)
Электрофорез с помощью акриламида (также известного как ПАГЭ) обычно используется для разделения белков на основе молекулярного размера и соотношения заряда и массы. С помощью вертикальных плит или геля, встроенных в вертикальные стержни или цилиндры, исследователи могут отделить ДНК из 100 пар оснований или меньше и проанализировать отдельные белки в сыворотке крови (например, генетические варианты, изоферменты). Помимо простоты и скорости разделения, исследователи любят PAGE, так как гели стабильны в широком диапазоне pH и температуры, и могут образовывать гели различного размера пор.
Капиллярный электрофорез (КЭ)
Капиллярный электрофорез осуществляется в капиллярах субмиллиметрового диаметра (т.е. в чрезвычайно тонких капиллярных трубках из плавленого кремнезема с внутренним диаметром от 25 до 100 мм) и сочетает в себе электрофорез и высокоэффективную жидкостную хроматографию для облегчения разделения анализируемых веществ. Многие исследователи предпочитают использовать капиллярный электрофорез, так как он требует лишь небольшого количества пробы, чрезвычайно эффективен, дает быстрые результаты и может быть легко автоматизирован.
Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ)
Если Вы хотите разделить амфотерные соединения (например, белки) с более высоким разрешением, то Вам необходимо использовать этот протокол. IEF использует химические инфузионные гели для создания градиента pH по всей поверхности геля и применяет чрезвычайно высокое напряжение для облегчения миграции белковых молекул до точки, где их чистый заряд равен нулю (изоэлектрическая точка). К некоторым преимуществам использования IEF относятся простота процедуры (т.е. размещение образца не имеет большого значения, так как белок всегда будет находиться в положении, соответствующем его pH) и высокое разрешение.
Иммунофиксационный электрофорез (ИЭФ)
Как правило, ИФЭ используется для выявления моноклональных иммуноглобулиновых гаммопатий или моноклональных расширений одного нефункционального антитела, такого как IgA, IgG и IgM, наличие которого может указывать на такие состояния, как множественная миелома или макроглобулинемия Вальденстрема. Оно также может быть использовано для изучения белковых антигенов и продуктов их расщепления.
Электрофорез импульсного полевого геля (PFGE)
Вы не можете разделять большие молекулы ДНК >50 килобаз (kb) с помощью AGE или PAGE в системах рутинного электрофореза, потому что размеры пор геля просто слишком малы, чтобы позволить их миграцию. Тем не менее, Вы можете использовать гель-электрофорез импульсного поля (ПФГЕ) для успешного фракционирования больших молекул ДНК (до 10 Мб).
PFGE эффективно разделяет фрагменты ДНК, применяя электрический ток, который постоянно меняет направление на гелевой матрице. Чередование положительных и отрицательных электродов в циклах во время электрофореза заставляет молекулы ДНК переориентироваться и в конечном итоге распадаться на более мелкие фрагменты. PFGE широко используется в генотипировании или генетической дактилоскопии и считается золотым стандартом в бактериальном субтипировании благодаря своей простоте и воспроизводимости.
Однако этот протокол чрезвычайно трудоемкий и требует высокого уровня навыков. Кроме того, результаты могут быть трудно интерпретированы, поскольку фрагменты разделены в соответствии с их размерами (т.е. разделение не основано на последовательности), а фрагменты одного и того же размера могут не поступать из одной и той же части хромосомы.
Добавить комментарий