Гид по градиентным гелям для электрофореза

Что такое градиентные гели?

Если вы еще не знакомы с основами электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), или если вам нужно освежить свои знания, ознакомьтесь с нашей статьей о том, как работает SDS-PAGE.

Как и полиакриламидные гели фиксированной концентрации, градиентные гели используют эффект «просеивания», созданный матрицей из полимеризированного акриламида. Чем выше концентрация полиакриламида, тем меньше размеры пор в матрице. Гели более высокой концентрации могут отделять или разрешать белки меньшего размера, в то время как гели более низкой концентрации, с большими размерами пор, лучше разрешают белки более высокой молекулярной массы.

В отличие от гелей с фиксированной концентрацией, градиентные гели получают диапазон концентраций полиакриламида, где непрерывный градиент начинается с более низкой концентрации и заканчивается более высокой.

Когда можно использовать градиентный гель?

Есть несколько преимуществ использования градиентных гелей, но они требуют более тонкой подготовки, чем стандартный однократный гель. Так зачем же прилагать дополнительные усилия для создания градиентного геля?

На одном геле можно разрешить более широкий диапазон размеров белков.

Это особенно полезно, если ваш образец ограничен и вы не можете запустить несколько гелей. Например, скажем, вы хотите разрешить белки размером от 200 кДа до 20 кДа. Глядя на руководство по процентному соотношению гелей в таблице 1, можно увидеть, что для разрешения белков, охватывающих этот диапазон размеров, потребовалось бы несколько фиксированных концентраций гелей. Запуск одного геля, несомненно, лучше, чем запуск трех или четырех!

Более четкие полосы

Подумайте об этом, в то время как белки мигрируют через полиакриламидную матрицу, передняя кромка сталкивается с меньшими размерами пор, чем задняя кромка. Это означает, что передняя кромка проходит через гель с немного более медленным темпом по сравнению с отставшей кромкой. Таким образом, полоса как бы накапливается сама по себе, точно так же, как и трафик, приближающийся к замедлению, в результате чего полоса становится более четкой. В то время как никто не заботится о пробках, более четкие полосы на геле позволяют получить идеальные данные для публикации с легкой интерпретацией!

Лучшее разделение белков похожих размеров

Вы запускаете свой гель, переводите на нитроцеллюлозу, запускаете вестерн-блот и наклоняете авторад в любом направлении, пытаясь уловить свет просто идеально, чтобы разобрать две полосы, которые, как вы только что узнали, находятся внутри этого размытого дубляжа. Есть и лучший способ — градиентный гель обеспечивает более острые, дискретные полосы, и чем дольше пробег, тем большее расстояние ты проложишь между близкими полосами.

Таблица 1: Размеры белков, разрешенных разными процентными долями геля

Размер белка Процент геля
4-40 кДа До 20%
12-45 кДа 15%
10-70 кДа 12.5%
15-100 кДа 10%
50-200 кДа 8%
>200 кДа 4-6%

Выбор правильного градиента

Знание того, какой градиент выбрать, зависит от размера белков, которые вы пытаетесь визуализировать на вашем геле.

Таблица 2. Примеры различных градиентов и их применения

Ряд размеров белков Нижняя / Верхняя концентрация геля Применение
4 – 250 кДа 4% / 20% Поиск подходящей концентрации геля
10 – 100 кДа 8% / 15% Более целенаправленный подход, но вы хотите избежать использования нескольких гелей
50 – 75 кДа 10% / 12.5% Разделение белков близких по размеру

Выбор буфера

Буферная система, используемая для заливки и запуска геля, также имеет большое значение. Например, белки, как правило, быстрее мигрируют через ту же самую концентрацию полиакриламида, если вместо MES использовать буфер, работающий на основе MOPS. Первый обеспечивает большее разрешение между полосами геля, в то время как второй позволяет визуализировать более широкий диапазон размеров белков. Несколько производителей готовых гелей предлагают исчерпывающие руководства, которые помогут вам выбрать гель, подходящий для вашей работы. Просто помните, что правильный выбор геля зависит от того, имеете ли вы представление о размерах белков, которые вы хотите видеть.

Сделайте или купите

Теперь, когда вы знаете, что такое градиентный гель, почему вы можете использовать его, и выбрали градиент для использования, большой вопрос заключается в том, стоит ли вам купить их или сделать свои собственные? Как и многие вещи в науке, есть компромиссы, и один из них — деньги против времени.

Покупка гелей, несомненно, быстрее с точки зрения практического использования и может даже позволить вам достичь более воспроизводимых результатов. Тем не менее, материалы дороже, и этот метод менее благоприятен для окружающей среды.

С другой стороны, если вы можете сделать это самостоятельно, то отходов будет гораздо меньше. Тем не менее, вы потратите больше времени на подготовку гелей, и может потребоваться несколько попыток, чтобы усовершенствовать свои навыки градиентной заливки.

Как сделать градиентный гель

Если вы собираетесь создавать свои собственные, вот два способа сделать это. Но перед тем, как идти по этой дороге, убедитесь, что вы поняли, как налить идеальный гель SDS. Те же самые правила применяются при изготовлении градиентного геля.

1. Использование градиентного смесителя

При таком подходе используются две камеры, в одной из которых находится раствор акриламида с наименьшей концентрацией градиента, а в другой — более высокая концентрация акриламида. Гравитационный поток или насос используется для перемещения жидкости из камеры с более низкой концентрацией через камеру с более высокой концентрацией в блок для заливки геля. Обязательно дождитесь начала заливки, прежде чем добавлять персульфат аммония (APS) и TEMED (ингредиенты, инициирующие полимеризацию акриламида).

2. Пипетка с воздушным пузырьком

Если у вас не хватает терпения, чтобы настроить градиентный смеситель, есть лайф-хак, который позволяет приготовить градиентный гель гораздо быстрее и сделает вас похожим на геленаливного профи.

Приготовьте ваши растворы акриламида низкой и высокой концентрации в отдельных конических пробирках (в этот момент вы можете включить TEMED и APS).
С помощью серологической пипетки емкостью 5 или 10 мл наберите половину объема, необходимого для наливания геля, из пробирки низкой концентрации, а вторую половину — из пробирки высокой концентрации.
После удаления пипетки наберите немного воздуха, чтобы в пипетке образовался воздушный пузырь (около 0,5 мл), и дайте пузырьку воздуха подняться вверх по дозатору, чтобы смешать акриламид на пути вверх.
Медленно пипетируйте градиентный раствор в гель.
Посмотрите видео, чтобы понять как происходит этот процесс: https://www.youtube.com/watch?v=zu5a-kpMK8k

Надеюсь, эта статья помогла вам понять, как и зачем делать градиентный гель. Мы будем рады услышать о вашем опыте создания и использования градиентных гелей, поэтому, пожалуйста, оставьте комментарий ниже!

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.