Культуральная среда, вероятно, является наиболее важным аспектом работы с клеточными культурами, и многие рецепты или коммерческие препараты являются результатом многолетнего совершенствования. Одной из распространенных добавок для сред для культивирования клеток является сыворотка, обычно фетальная бычья сыворотка (FBS). Но знаете ли вы, почему вы добавляете ее и, что более важно, могут ли ваши клетки выжить без нее? Мы обсудим плюсы и минусы использования сыворотки в среде для культивирования клеток и способы ее удаления, если вы хотите исключить ее из рабочего процесса.
Какова важность сыворотки в моих средах?
Среда содержит витамины, сахара и буферные агенты для поддержания здоровья клеток. И вы будете часто добавлять сыворотку, например, FBS. Фетальная бычья сыворотка один из основных ингредиентов в среде для культивирования клеток, поскольку она содержит гормоны, липиды и факторы роста, необходимые для пролиферации и роста клеток.
Если вы удалите сыворотку из культуральной среды, вы заметите большую разницу. Сывороточное голодание используется, чтобы вызвать синхронизацию клеточного цикла, но будьте осторожны, так как долгое отсутствие сыворотки приведет к снижению выживаемости клеток и увеличению апоптоза.
Почему следует задуматься об отказе от сыворотки?
Хотя сыворотка может сохранить ваши клетки здоровыми и счастливыми, есть некоторые заметные недостатки.
Сыворотка очень изменчива
Для начала, сыворотка — это натуральный продукт животного происхождения, и каждая новая партия будет иметь новый состав. Хотя сыворотка содержит элементы, важные для здоровья ваших клеток, она также содержит такие вещи, как иммунные белки, которые могут повредить вашим клеткам.
Для того, чтобы обойти эту проблему, сыворотку обычно нагревают для инактивации вредных белков. Конечно, тепло также денатурирует полезные белки, что может увеличить вариабельность состава среды.
Хотя это не может быть большой проблемой для некоторых видов исследований, изменчивость факторов, критических для роста и выживания клеток, может повлиять на ваши результаты, если вы проводите, например, клеточный анализ, измеряющий влияние фактора роста или лекарственного средства на данную клеточную функцию.
В этом случае одной из главных причин отсутствия сыворотки является повышение стандартизации условий культивирования для получения более последовательных результатов. Этот тип стандартизации еще более важен в регулируемых лабораториях, и использование определенной среды позволяет лучше контролировать культуру клеток и ваши эксперименты.
Сыворотка может быть источником загрязнения
Другая потенциальная проблема с сывороткой — это вирусное или бактериальное загрязнение. Опять же, изменчивость от партии к партии здесь играет свою роль, и тепловая инактивация может не полностью нейтрализовать микробные патогены. Добавление загрязненной сыворотки в вашу культуру повлияет на здоровье и рост ваших клеток и сделает их непригодными для экспериментов.
Сыворотка — продукт животного происхождения
Наконец, еще одно соображение, касающееся отсутствия сыворотки, — это поддержка трех R (refinement, reduction, replacement) — уточнение, уменьшение и замена — для использования животных в исследованиях.
Существуют ли негативные последствия перехода на бессывороточные среды?
Может быть, вы уверены, что отсутствие сыворотки — лучший подход для вашей клеточной культуры. Но, как и многие вещи в науке, это связано с компромиссами, и одна из них заключается в том, чтобы найти именно правильное сочетание факторов роста для поддержки вашей культуры.
Потребности различных установленных клеточных линий разнообразны и сложны. Оптимальные условия культивирования могут даже меняться между разными пассажами клеток! Вбросьте первичную культуру или культуру в суспензию, и перед вами встанет задача. К счастью, вы не одиноки, и есть много опытных источников в Интернете, чтобы помочь вам. Различные производители культуральных сред разработали специальные бессывороточные составы для стандартных линий иммортализованных клеток, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО).
Помимо трудностей с получением правильных условий без сыворотки, другие неблагоприятные эффекты отсутствия сыворотки включают более медленный рост клеток и скопление клеток при пассировании. Дальнейшая оптимизация условий культивирования может помочь в снижении скорости роста, и для их рассеивания должно быть достаточно осторожного повторного пипетирования сгустков клеток.
Как перейти на бессывороточность?
Теперь, когда мы рассмотрели все плюсы и минусы отсутствия сыворотки, давайте рассмотрим, как это сделать на практике. Обратите внимание, что некоторые типы клеток можно культивировать при полном отсутствии сыворотки, в то время как другим потребуются другие факторы, добавленные для замены роли сыворотки в среде. Можно приобрести несколько альтернатив сывороток, которые вы можете попробовать в качестве альтернативы полному удалению сыворотки, однако некоторые типы клеток будут иметь больше уникальных потребностей, которые требуют добавления определенных факторов в среду. База данных free-FCS содержит подробную информацию о добавках, отмеченных в литературе, для культивирования определенных клеточных линий без фетальной телячьей сыворотки.
Прямая адаптация
Один из подходов к переходу на бессывороточную среду заключается в простом переключении с сывороточной среды на бессывороточную. В руководстве от ThermoFisher они предлагают начать с культивирования в средней логарифмической фазе с > 90% жизнеспособностью и субкультивированием, когда плотность клеток увеличивается после нескольких дней культивирования в бессывороточной среде. Если вы работаете с клеточной линией, которая может переносить прямое переключение, отсутствие сыворотки будет относительно безболезненным.
Постепенная адаптация
Но, если вы не можете бросить сразу отказаться от использования сыворотки, вам придется пересевать клетки в смеси с сывороткой и без сыворотки, увеличивая долю бессывороточной среды с каждым пассажем до тех пор, пока вы не перейдете в 100% бессывороточную среду.
Другой подход заключается в добавлении смеси бессывороточной среды с кондиционированной средой. Если вы не знакомы с этим термином, кондиционированная среда — это среда, в которой клетки выращивались за один полный пассаж. Вы можете перерабатывать ее и смешивать с увеличивающимися соотношениями бессывороточной среды, пока клетки не будут адаптированы на 100%.
Один комментарий