Экспрессия МикроРНК: Как выбрать правильную платформу профилирования

miRNA — это высоко консервативные маленькие некодирующие РНК, которые отрицательно регулируют ряд процессов в здоровом и больном состоянии, а также являются ценными биомаркерами для различных состояний. Именно поэтому профилирование МикроРНК в настоящее время представляет огромный биологический интерес и является быстро развивающейся областью исследований. Но прежде чем вы начнете расшифровывать то, как интересующая вас miRNA регулирует биологический ответ, понадобится чувствительная, воспроизводимая и широко принимаемая платформа профилирования miRNA для измерения экспрессии. В этой статье мы обсудим, какие вещи необходимо учитывать при выборе платформы для профилирования miRNA, а также различные доступные опции.

На что обратить внимание при выборе платформы для профилирования miRNA

Существует широкий спектр платформ профилирования МикроРНК и множество факторов, которые необходимо учитывать при проектировании вашего эксперимента, начиная от стоимости и заканчивая точностью. Поэтому выбор платформы профилирования для вашего эксперимента может быть непростым. Вот краткое обсуждение того, что необходимо учитывать при выборе платформы профилирования miRNA:

• Цель: Ваша цель — получить точную общую картину репертуара miRNA, понять процесс созревания miRNA или углубиться в биологическое значение выбранного набора miRNA?
  Динамический диапазон: Вы хотите обнаружить 2- или 2×10⁶-кратное изменение в интересующей Вас miRNA?
• Специфичность: Зрелые miRNA, варьирующиеся между 19 и 25 нуклеотидами, возникают из более длинных предшественников в результате многоступенчатого биогенеза. Это создает гетерогенный пул miRNA с небольшими отличиями, которые могут регулировать различные наборы мишеней. Знаете ли Вы, какую стадию процесса биогенеза miRNA Вы собираетесь профилировать? Способна ли ваша платформа различать незрелые и зрелые miRNA или МикроРНК с очень похожими последовательностями?
• Анализ: Есть ли у Вас бюджет для проведения обширного биоинформационного анализа.
• Временные затраты: Нужны ли результаты в течение нескольких часов, или вы можете уделить эксперименту несколько недель? Есть ли у вас время для изучения сложных анализов?

Какие варианты есть?

А теперь давайте поговорим о платформах, которые вы можете использовать для профилирования МикроРНК. У каждой платформы есть свои плюсы и минусы, и ваш выбор в конечном итоге будет зависеть от ваших приоритетов в отношении стоимости, времени, навыков, чувствительности, точности и, конечно же, воспроизводимости:

1. Количественная ПЦР в реальном времени

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) является золотым стандартом в любых экспериментах по экспрессии генов, а также доступна для обнаружения миРНК на любой стадии созревания. При этом анализе miRNA в гетерогенной смеси тотальных клеточных РНК амплифицируются с помощью специфических праймеров.

Плюсы

• В качестве входного сигнала удобно использовать общую РНК, поэтому предварительной калибровки не требуется.
• Быстро
• Широко распространено мнение, что метод имеет высокую воспроизводимость.

Минусы

• qRT-PCR праймеры для Ваших МикроРНК используются во время усиления, что означает, что Вы должны знать, какие именно последовательности вы ищете.
• Предпочтения отдаются в пользу предварительно определенных miRNA.
• Анализ с высокой пропускной способностью является сложным, так как анализ нескольких miRNA параллельно в одних и тех же условиях ПЦР реакции невозможен, так как они по своей природе сгибаются, образуя шпильки.

2. Микрочип на основе гибридизации

Эта техника была хорошо оптимизирована в течение последних десятилетий и предлагает надежную возможность для профилирования miRNA. Здесь общая маркированная РНК из образцов тканей или клеток гибридизуется в стандартные стеклянные решетки для всех зрелых miRNA интересующих Вас видов. Сырые данные затем используются для расчета сложных тепловых карт для сравнения различных образцов.

Плюсы

• Поскольку микроРНК намного меньше типичного транскрипта, даже короткие олигозонды на микрочиповом слайде гибридизируются с высокой точностью, снижая затраты на генерацию микрочипов. Более короткие зонды miRNA также повышают чувствительность и специфичность обнаружения.
• По мере обнаружения новых miRNA, специальные микрочипы вмещают весь набор известных miRNA на одном чипе, что позволяет проводить быстрый и надежный высокопроизводительный анализ, который был подтвержден на более широко распространенных платформах, таких как qPCR и Northern blots.

Минусы

• Так как miRNA намного меньше, чем типичный транскрипт и может составлять лишь ограниченную часть от общего количества образца РНК клетки или ткани, возможно, потребуется обогатить ваш образец путем предварительного отбора размера, если необходимы точные измерения зрелости пре-микроРНК.
• С другой стороны, так как объем клинических образцов часто ограничен, общее количество извлекаемой микроРНК часто невелико. Неспецифическое усиление может быть использовано для увеличения образца miRNA, но при измерении уровней экспрессии это означает, что Вы потеряете прямое соответствие между общим количеством входной пробы и количеством измеренных miRNA, что вносит нелинейность в анализ.

3. Секвенирование следующего поколения (NGS)

Секвенирование следующего поколения (Next-Generation Sequencing, NGS) быстро набирает популярность в биологических и клинических лабораториях и предлагает еще один метод для изучения профилей экспрессии микроРНК. NGS предполагает подсоединение адаптеров к образцу РНК и генерацию кДНК-библиотек с помощью ПЦР-амплификации. Библиотеки затем скринингуются на длины, соответствующие miRNA и выравниваются по подходящим эталонным последовательностям.

Плюсы

• Идентифицирует все молекулы микроРНК в анализируемом образце и не ограничивается скоростью открытия новых микроРНК и изоформ последовательности.
• Высокая пропускная способность
• Имеет потенциал для автоматизации, что может свести к минимуму время ручной работы и уменьшить количество ошибок при ручной выборке.
• Может одновременно измерять уровень экспрессии и вариации последовательности.

Минусы

• Длительное время исследования.
• Требуется квалифицированный персонал для анализа данных.
• Потенциал нелинейности в измерениях из-за усиления.

4. Нозерн-блот гибридизация

Традиционный нозерн-блоттинг обнаруживает специфические молекулы РНК в гетерогенной смеси. Этот метод включает в себя электрофоретическое разрешение тотальной клеточной РНК, промокание на мембрану и гибридизацию меченых зондов для визуализации интересующей вас РНК на рентгеновской пленке. Несколько улучшений было сделано в традиционном протоколе, чтобы предложить разрешение достаточно высокое, чтобы обнаружить изменения отдельных нуклеотидов и очень короткие РНК.

Плюсы

• Превосходные чувствительность и специфичность для малых количеств микроРНК.
• Более высокая чувствительность в обнаружении небольших изменений в уровнях экспрессии, которая недоступна на микрочипах.
• Предварительно разработанные зонды легко доступны для всех видов miRNA с широким выбором меток, которые позволяют мультиплексировать и колокализовать анализы.
• Поскольку образец не усиливается ни на одном из этапов, вы можете обнаружить МикроРНК в общей РНК, а не в искусственно усиленной смеси.
• Благодаря электрофоретическому разрешению, можно оценить размер miRNA в дополнение к уровню ее экспрессии.
• Мембраны для блоттинга можно хранить, снимать и перепрофилировать в течение многих лет.

Минусы

• Анализ отнимает много времени
• Необходим большой объем образца для анализа.
• Для повышения чувствительности обнаружения микроРНК с низкой плотностью залегания в общей массе РНК часто требуется радиоактивное маркирование.
• С трудом применяется для высокопроизводительного анализа и используется для оценки одного или небольшого количества микроРНК.

5. Анализ защиты от РНКаз

Идея этого анализа основана на любопытном факте, что ферменты РНКазы измельчают только одноцепочечную РНК, оставляя двухцепочечную РНК нетронутой. Образцы РНК гибридизируются комплементарными зондами микроРНК, инкубируются с РНКазой для отсечения негибридных одноцепочечных РНК, растворяются на полиакриламидном геле и промокаются на мембрану для определения интенсивности сигналов соответствующих меченым miRNA, которые были привязаны к зондам.

Плюсы

• Предложите превосходную чувствительность и специфичность для низкоинтенсивных миРНК.
• Заранее спроектированные зонды легко доступны для всех видов miRNA с широким выбором этикеток, которые позволяют проводить мультиплексирование и колокализацию.
• Так как образец не усилен ни на одном из этапов, Вы обнаруживаете интересующие Вас miRNA не в искусственно усиленной смеси, а в пуле общей РНК.

Минусы

• Отнимает много времени.
• Большой объем образца для анализа.
• Для повышения чувствительности обнаружения микроРНК с низкой плотностью залегания в общей массе РНК часто требуется радиоактивное маркирование.
• Очень трудно производить высокопроизводительный анализ.
• Последовательность микроРНК должна быть известна.
• Несмотря на ограничения, присущие нозерн-блоттингу и анализу защиты от РНКаз, они часто используются в качестве вторичных протоколов для подтверждения результатов, полученных другими методами.

6. Платформы профилирования miRNA на основе нанотехнологий

Это недавняя инновация, которая все еще находится в основном на стадии исследований и разработок. В этих методах используются разработанные нанопоры — поры молекулярного масштаба — и их электропроводящие характеристики для определения положения и конформации селективно отдельных молекул микроРНК внутри нанопора.

Плюсы

• Предоставляет специфические, количественные и объективные данные о количестве, длине и конформации микроРНК.
• Не требует ферментативных шагов, таких как маркировка, обратная транскрипция или амплификация.

Минусы

• В настоящее время метод не доступен для коммерческого использования.

Сводная таблица сравнения методов анализа экспрессии МикроРНК

Подводя итог, если вы придерживаетесь традиций и склоняетесь к использованию ручных протоколов, на которые вы можете потратить всю жизнь, вы можете сделать выбор в пользу традиционных платформ и провести анализ защиты от РНКаз или нозерн блоттинг для измерения уровней экспрессии miRNA в ваших образцах. Если это не так, вы можете выбрать текущий золотой стандарт в исследовательской литературе и выполнить количественную ПЦР в реальном времени. А если вас беспокоит предвзятость в более традиционных методах и у вас есть время и средства, вы можете инвестировать в оптимизацию анализа на основе нанотехнологий.

Все вышесказанное поможет найти оптимальный баланс между стоимостью, целесообразностью, точностью и доступностью, а также оптимизировать метод, идеально подходящий для вас. Вам нужно будет рассмотреть все «за» и «против» каждой платформы профилирования с особой тщательностью.