Иммунофлуоресцентное окрашивание является популярным и чрезвычайно мощным методом обнаружения. Тем не менее, достижение качества публикации иммунофлуоресценции или окрашивания флуоресцентных антител может быть сложно. Всегда важно убедиться, что у вас есть правильный контроль для иммунофлюоресценции.
Поскольку иммунофлуоресцентное окрашивание является длительным процессом, состоящим из нескольких этапов, всегда желательно потратить некоторое время на оптимизацию каждого этапа протокола, прежде чем вы решите сгенерировать данные из материала образца. Всегда ведите подробный учет, чтобы обеспечить стабильную производительность, поскольку любые изменения будут влиять на воспроизводимость окрашивания.
По моему опыту, первым шагом к получению воспроизводимого и качественного окрашивания является знание того, что оно является специфическим. Эта статья позволит вам выбрать правильные элементы управления для вашего эксперимента и использовать их, чтобы решить, сработало ли ваше окрашивание или нет.
Зачем нам нужен контроль для иммунофлуоресценции?
При иммунофлуоресценции красочные изображения настолько убедительны, что трудно представить, что содержащаяся в них информация может быть неправильной. Однако опытные ученые знают, что для того, чтобы доверять окрашиванию, вам нужны средства контроля, показывающие, что оно является специфическим. Например, чтобы знать, что окрашивание является реальным, а не возникло из-за аутофлуоресценции или неспецифического окрашивания, вам нужно не включать первичные антитела или изотипические контроли в свой эксперимент. Включение элементов контроля упрощает интерпретацию данных и помогает сузить проблему для устранения неполадок, например, когда вы не получаете сигнал.
Что могут рассказать различные контроли для иммунофлюоресценции?
Тип используемых иммунофлуоресцентных контролей будет зависеть от цели вашего иммунофлуоресцентного эксперимента. Для примера, если вы пытаетесь проверить линии Нокаут клеток, важно установить специфичность антитела. Наиболее часто используемые контроли включают контроль, чтобы показать специфическое связывание антитела (без первичного контроля), положительный контроль и отсутствие вторичного контроля антител, чтобы понять фоновый сигнал аутофлуоресценции. Я перечислил пять контролей, и каждый из них дает вам различную информацию для подтверждения вашего окрашивания.
Положительный контроль
Это один из контролей иммунофлуоресценции, который вы всегда должны использовать в своих экспериментах, так как это важно для определения того, что что-то пошло не так во время окрашивания. Положительным контролем может быть любая ткань или клетки, в которых, представляющий интерес белок экспрессируется в изобилии (или если у вас избыточная экспрессия белка посредством трансфекции). Если вы не видите окрашивания в положительном контроле, вы знаете, что что-то пошло не так.
Отсутствие первичного контроля антител
Инкубация образца с буфером для разведения антител без первичного антитела покажет, является ли наблюдаемый сигнал следствием неспецифического связывания вторичного антитела в образце ткани или клетки. Иногда вторичные антитела образуют агрегаты и могут рассматриваться как остатки в образце. Это может произойти из-за неправильных условий хранения. Поэтому всегда храните ваши антитела в соответствии с указаниями производителя, и рекомендуется хранить их в меньших аликвотах, чтобы избежать деградации от частых циклов замораживания-оттаивания.
Обратитесь к поставщику, чтобы определить, предварительно ли абсорбируются ваши вторичные антитела. Предварительная адсорбция является дополнительной стадией обработки, где вторичные антитела пропускаются через колонку, содержащую иммобилизованные сывороточные белки из потенциально перекрестно реагирующих веществ. Использование предварительно адсорбированных вторичных антител снижает риск перекрестной реактивности с неспецифическими мишенями.
Контроль поглощения
Это контроль, в котором вы инкубируете свой образец с истощенным иммунитетом первичными антителами. Он демонстрирует специфичность вашего первичного антитела, и вы не должны видеть сигнала от истощенного иммунитета первичного антитела. Плохо реагирующие антитела могут быть получены путем инкубации в течение ночи антитела при 4 O С с избытком иммуногена. Хотя это настоятельно рекомендуется, этот контроль не так популярен из-за ограничений в получении очищенного антигена/иммуногенов. Этот контроль более надежен, когда иммуноген представляет собой пептид, а не белок.
Контроль изотипа
Инкубация образца с неиммунным антителом того же изотипа (например, IgG 1 , IgG 2A , IgM) и в той же концентрации, что и у вашего основного антитела. Этот контроль показываетт, что наблюдаемое окрашивание не вызвано неспецифическими взаимодействиями первичного антитела. Любое окрашивание фона, которое вы наблюдаете с помощью этого элемента управления, должно быть минимальным и отличным от вашего конкретного окрашивания. Этот контроль полезен при работе с первичными моноклональными антителами.
Отсутствие вторичного контроля антител
Образцы, такие как мозг, легкие и толстая кишка (богатые эластином, коллагеном и липофусцином), имеют высокую аутофлуоресценцию. Никакие вторичные контрольные антитела не помогают определить, происходит ли наблюдаемая флуоресценция от фоновой аутофлуоресценции. Если вы обнаружите, что у вас появляется аутофлуоресценция, не беспокойтесь — есть способы, которые вы можете применить, чтобы ее уменьшить.
Как и в любом другом эксперименте, использование правильных элементов управления для иммунофлуоресценции может сэкономить вам много работы и реагентов, позволив вам устранить причину проблемы. Благодаря тщательному отбору антител и протоколу окрашивания можно получить массу полезных данных.
Добавить комментарий