Иммунология или Иммуноалхимия?

Прежде всего позвольте мне сказать, что метод маркировки тканей (иммуногистохимии, IHC), и клетки (иммуноцитохимия, ICC) действительно иммуно наука, а  НЕ алхимия, хотя иногда это, конечно, может показаться алхимией!

Но ученым, неопытным в этой технике, которые обычно видят результаты экспериментов IHC / ICC в виде симпатичных картинок, это может показаться алхимией.

В то время как эти картинки могут быть красивыми сами по себе, они отображают ряд важной научной информации. Наблюдатель часто думает, что процесс, время и навыки, связанные с получением этих изображений, относительно малы и их легко сделать. Однако, значительная часть экспериментальных условий IHC / ICC определяется опытным путем. Метод проб и ошибок является частью всех научных исследований, и IHC / ICC не является исключением.

Цель этой статьи — дать новичку список некоторых начальных переменных, о которых следует подумать, прежде чем пытаться выполнить свой первый набор экспериментов IHC / ICC. У меня есть одно предостережение: возможно, есть исключение из большинства того, что я могу сказать ниже.

Итак, вот что вам нужно для достижения золотых (а не свинцовых) результатов IHC / ICC…

Фиксация

В инвестировании в недвижимость известной фразой, которая описывает потенциальный инвестиционный успех, часто является «местоположение, местоположение, местоположение». То же самое можно сказать и о IHC / ICC: «фиксация, фиксация, фиксация». Этот шаг является первым и, возможно, самым важным шагом в получении успешных результатов в экспериментах IHC / ICC. Неправильный протокол фиксации почти гарантирует, что вы получите нежелательные результаты, то есть отсутствие сигнала от белка, который вы пытаетесь наблюдать в вашем образце. Сами протоколы фиксации имеют широкий диапазон переменных, таких как:

Химические вещества, используемые для фиксации образца (параформальдегид, метанол, ацетоновые смеси и другие)

Температура (от 4°С до 37°С) и

Время (от 15 минут до ночи), на которое следует фиксировать образец

Выбор первичных антител

Будете ли вы использовать моноклональные или поликлональные антитела, когда следует использовать одно поверх другого? У кого покупать? Я расскажу об этом в следующей статье. Осторожно: ответы могут быть длинными!

Контроли

Существует два типа элементов управления, которые следует использовать: отрицательный контроль и положительный контроль. Каждый элемент управления говорит вам что-то свое и используется для обеспечения точной интерпретации ваших результатов.

Отрицательный контроль, в котором вы используете первичное антитело и вторичное антитело в экспериментальной группе, состоит из пропуска первичного антитела в отрицательном контроле. Этот отрицательный контроль даст вам представление о том, какой сигнал, если таковой имеется, обусловлен только вторичным антителом.

Другой тип отрицательного контроля мог бы заменить первичное антитело неиммунной сывороткой или даже лучшей преиммунной сывороткой с последующим обнаружением вторичным антителом.

В случае ICC, где экспериментальная группа представляет собой клетки, трансфицированные, например, для экспрессии вашего белка, использование родительских клеток не должно давать специфического сигнала из-за первичного антитела.

Положительный контроль говорит вам о двух вещах: правильна ли ваша техника, и определяет ли основной объект соответствующую цель. Положительный контроль может принимать разные формы в зависимости от типа эксперимента. В случае IHC следует использовать отдельное предметное стекло с тканями, которые, как известно, являются иммунопозитивными для интересующего вас белка.

Вы должны помнить: если вы маркируете интересующий белок антителом, вы можете наблюдать фоновую маркировку. Фон может быть результатом связывания первичным, вторичным или обоими. Антитела по своей природе являются «липкими» белками, поэтому антитело необязательно может связываться только с правильным эпитопом, создавая таким образом ложноположительный результат. Если у вас есть надлежащие средства управления, они только сделают ваши результаты более убедительными, если вы получите истинный сигнал.

Детекция сигнала

Короче говоря, будете ли вы использовать хромагенный субстрат, который требует светлопольной микроскопии для наблюдения картины окрашивания, или вы будете использовать флуорофоры, обычно конъюгированные с антителами, чтобы увидеть флуоресцентный сигнал? Ответ зависит от ваших потребностей.

Вам нужно увидеть структуру вашего образца и только один белок? Если так, то используйте светлое поле. Или вам нужно пометить два или более белка для колокализации? Если это так, то используйте микроскоп, оборудованный для флуоресценции.

В эпоху компьютеров с помощью подходящего оборудования можно наложить флуоресцентное изображение на изображение в светлом поле, поддерживая таким образом способность видеть как клеточную структуру, так и локализацию белка. Однако, если вы используете только одну метку и вам требуется структура образца, вы, как правило, добьетесь лучших результатов с помощью светлопольной микроскопии.

Микроскопия

Благодаря последним достижениям в области микроскопии можно использовать различные технологии микроскопии для наблюдения за вашими результатами. Если у вас есть основной инструментальный центр, и вы не уверены, что использовать, даже после того, как прочитали и спросили друзей, я рекомендую обратиться к директору объекта за советом.

Вообще говоря, люди получают более четкие изображения с помощью лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, чем со сложными микроскопами. Однако, чтобы быть справедливым, это также зависит от вашего образца. Есть случаи, когда оборудованный для флуоресценции микроскоп давал изображения лучше, чем конфокальный микроскоп. Обработка изображения

Многие люди используют различные программы для постобработки изображений, которые обычно получают в цифровом виде. Одним из важных советов является всегда сохранять исходный файл изображения. Никогда не вносите изменения в исходное изображение, сохраняя его, сохраняйте изменения как новый файл. Если вы потеряете оригинал, у вас возникнут проблемы, если вам когда-нибудь понадобится воспроизвести оригинал, особенно в научной редакционной коллегии или для расследования в университете.

Кроме того, прежде чем вносить изменения в изображения, решите, в какой журнал вы собираетесь отправлять документы, и посмотрите, каковы их критерии приемлемого изменения исходных изображений.

Некоторые издатели журналов в настоящее время имеют команды криминалистического анализа изображений, и все представленные изображения проходят через специальное программное обеспечение, которое может определить, какие типы изменений были внесены в изображение. Ученых попросили воспроизвести оригиналы или просто вернуться назад и изменить оригинальное изображение только с принятыми типами изменений, разрешенными журналом.

IHC / ICC — действительно полезный метод, но, как и все другие полезные методы, только если он выполняется с должной осторожностью и вниманием.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.