Красители Alexa

Задолго до того, как «Alexa» стала общеизвестным названием, красители под этим названием были признанной серией флуоресцентных красителей. Изобретатель Ричард Пол Хогланд (Richard Paul Haugland) назвал краски в честь своего сына Алекса. Первоначально торговая марка Molecular Probes, семейство Alexa в настоящее время является частью Thermo Fisher Scientific. Эти красители часто используются в качестве меток в флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и других методах, использующих флуоресценцию.

Свойства

Семейство Alexa охватывает широкий спектр длин волн возбуждения и излучения от видимого до инфракрасного света и классифицируется в соответствии с их максимумами возбуждения (таблица 1). Хотя их химическая структура еще не опубликована, красители Alexa обычно синтезируются путем сульфирования таких красителей, как флуоресцеин, цианин, кумарин и родамин. Это сульфирование делает красители Alexa отрицательно заряженными и гидрофильными.

Красители Alexa коммерчески доступны в виде промежуточных продуктов, реагирующих с амином, тиолом или сульфгидрилом, которые могут быть конъюгированы с белками в лабораторных условиях, поскольку белки имеют первичные амины и сульфгидрильные группы, которые можно легко пометить. Олигонуклеотиды также могут быть помечены, когда они синтезируются либо с аминогруппой, либо с сульфгидрильной реакционноспособной группой.

Таблица 1: Информация об особенностях красителей Alexa от Thermo Fisher Scientific.

Эмиссия от красителей Alexa может быть обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии с соответствующими фильтрами. Как вы можете видеть на рисунке 1, этот диапазон красителей обеспечивает впечатляющий диапазон длин волн излучения!

Приготовление образцов с использованием Alexa конъюгированных вторичных антител

Образцы, конъюгированные с Alexa, следует хранить в темноте, когда они не используются. Это связано с тем, что воздействие света может привести к фотообесцвечиванию и ухудшению характеристик красителя. Во время этапа конъюгации образцы следует инкубировать при комнатной температуре в течение определенного периода времени, предоставленного производителем, или при 4°C в течение более продолжительных периодов времени, например, в течение ночи. Конъюгированные образцы имеют отличную амплификацию сигнала и обычно разбавляются в блокирующем буфере для уменьшения неспецифического связывания. Например, концентрация конъюгата Alexa Fluor IgG от 1 до 10 мкг/мл может быть использована для антител, меченных флуорофором и биотином, и антител, меченных тандемом, в иммуногистохимических исследованиях. Красители Alexa также совместимы с общими фиксаторами, такими как параформальдегид и чувствительны к типичным гасителям, таким как трипановый синий.

Применение

Красители Alexa предназначены для разнообразных исследований, в том числе:

• Получение изображений в реальном времени и анализ фиксированных клеток . Красители Alexa устойчивы к фотообесцвечиванию даже при воздействии высокоинтенсивных лазерных источников. Это делает Алекса красители особенно подходящими для клеточной микроскопии.
• Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET): Широкий спектр красителей Alexa обеспечивает несколько вариантов FRET при конъюгировании с белками или олигонуклеотидами. Перекрывающиеся спектры излучения также полезны для сложной конфокальной микроскопии и при исследовании нескольких меток с использованием псевдоцветных методов.
• Иммуногистохимические исследования: вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor, идеально подходят для мультиплексирования благодаря их высокой специфичности и чувствительности.
• Иммунофлуоресценция: некоторые красители Alexa испускают красную флуоресценцию и поэтому являются лучшим выбором для иммунофлуоресценции в глубоких красных спектрах.

Преимущества

Красители Alexa представляют собой серьезную разработку в области применения флуоресценции, поскольку они обладают многими преимуществами, в том числе:

1. Яркость: конъюгаты Alexa Fluor демонстрируют большую яркость, чем другие спектрально подобные конъюгаты. Таким образом, они требуют меньшего общего количества образцов в экспериментах, позволяя обнаруживать мишени с низким содержанием.
2. Фотостабильность: конъюгаты Alexa Fluor обладают большей фотостабильностью, чем другие, что дает больше времени для захвата изображений.
3. Химическая стабильность: красители Alexa остаются высоко флуоресцентными в широком диапазоне рН от 4 до 10.
4. Растворимость в воде: Конъюгирование с мишенями может быть выполнено без использования органических растворителей, и полученные конъюгаты устойчивы к осаждению во время хранения.
5. Совместимость: красители Alexa можно использовать с соответствующими стандартными фильтрами, источниками возбуждения и инструментами.
6. Разнообразие длин волн: красители Alexa легко доступны с широким спектром флуоресцентных цветов от синего до красного.

Альтернативы стандартным красителям

Краски Alexa могут заменить многие стандартные красители после тщательного рассмотрения. Если вы хотите перейти на красители Alexa, вам следует сравнить характеристики, в том числе спектры поглощения и эмиссии, сдвиг Стокса, рН-чувствительность, устойчивость к фотообесцвечиванию, коэффициент экстинкции и квантовый выход. Важно отметить, что все красители Alexa представляют собой сульфированные формы различных основных флуоресцентных веществ, поэтому они часто сходны со стандартными красителями по максимумам возбуждения и эмиссии (таблица 2).

Таблица 2: Информация о красителях Alexa в качестве альтернативы обычным красителям, полученная от Thermo Fisher Scientific.

С учетом сказанного, красители Alexa часто дороже, чем обычные. Доступны также серии флуоресцентных красителей, похожих на Alexa Fluor, таких как DyLight Fluor и Atto. В то время как выбор лучшего красителя для конкретного применения может быть затруднительным, широкий выбор красителей очень интересен. Всегда проводите эмпирическое тестирование для проверки новых красителей, будь то краситель из семейства Alexa или другого!