Пять методов оценки чистоты и качества белка

Если вы когда-либо работали с белками в лаборатории, вы, вероятно, знаете, насколько важны чистота и качество белка для последующих экспериментов. В этой статье мы рассмотрим как вы можете проанализировать чистоту и целостность вашего любимого белка перед его использованием в важных экспериментах.

Проблемы, связанные с плохим качеством образца белка

Неважно, является ли ваш белок не совсем чистым или плохого качества, плохие пробы приводят к множеству проблем, которые приводят к низкой точности в экспериментах, а иногда могут привести к полному провалу экспериментов. Вот несколько конкретных вопросов, на которые следует обратить внимание:

1. Белки могут неправильно сворачиваться, агрегировать и выпадать в осадок из раствора, что часто является необратимым процессом, если его тщательно не контролировать (например, при осаждении в соли). Агрегация и деградация также приводят к тому, что белки не «ведут себя» так, как в естественном состоянии, поэтому они могут неправильно связываться с другими белками или молекулами. Иногда агрегация четко видна в образце на глаз, но это не всегда так.
2. Когда ферменты становятся инактивированными или неправильно упакованными, ферментные анализы не дают результатов или приводят к плохой воспроизводимости. Это может иметь особое значение, если вы используете ферментные анализы в качестве индикаторов для других белков, представляющих интерес.
3. Гидролиз белков приводит к вышеуказанным проблемам в дополнение к риску потери тщательно сконструированных функциональных меток. Несмотря на то, что существуют агенты, которые уменьшают гидролиз и деградацию в образцах белка, всегда существует риск гидролиза, когда ваш белок хранится в водном растворе.

Очевидно, что важно потратить некоторое время на тщательный контроль факторов, влияющих на качество белка. Вероятно, у вас есть некоторый контроль над условиями хранения, включая pH, буфер, концентрацию соли, концентрацию белка и температуру хранения. При этом качество белка может меняться со временем даже при самых оптимальных условиях приготовления и хранения. Это означает, что вы должны регулярно проверять свои образцы белка, чтобы убедиться, что они соответствуют вашим экспериментам!

Потеря времени на проверку качества белка перед тем, как приступить к затратным по времени или дорогостоящим методам, может реально помочь сэкономить время и деньги в долгосрочной перспективе.

Надежные методы измерения чистоты и качества белка

1. Общая количественная оценка: UV-Vis спектрофотометрия, анализ по методу Брэдфорда и анализ активности

Измерение концентрации образца белка обычно требуется для того, чтобы многие из методов, описанных далее в этой статье, были эффективными.

Хотя спектрофотометрия UV-Vis и анализ по Брэдфорду являются высокопроизводительными и используются почти в каждой биохимической лаборатории, они являются относительно грубыми по сравнению с анализами ферментативной активности. Это связано с тем, что результаты спектрофотометрии и Брэдфорда зависят от общего содержания белка в образце. Напротив, анализы активности являются специфичными для мишени и имеют дополнительное преимущество измерения доли активного белка в очищенном образце. Однако не все белки могут быть количественно определены с помощью анализа активности.

2. Анализ размера: электрофорез (нативный / денатурирующий PAGE)

Как и методы количественной оценки, описанные выше, электрофорез широко используется биохимиками и может дать общую картину как размера целевого белка, так и наличия других белковых примесей. Существует несколько типов методов электрофореза, наиболее распространенным из которых является денатурирующий SDS-PAGE. Образцы сначала денатурируют с помощью SDS (детергента), затем разделяют по массе на матрице из полиакриламидного геля с использованием электрического поля. В нативном PAGE разделение белка является более сложным и основано на чистом заряде, размере и форме нативной структуры. В обоих методах вы можете определить наличие деградации в образце из-за «смазанной» полосы, но это также может произойти, если вы перегружаете гель слишком большим количеством белка.

Некоторые проблемы электрофореза включают в себя то, что он не обнаруживает примеси низкого уровня или незначительные различия в размерах. Электрофорез также требует образцов с концентрацией от 0,1 до 2 мг/мл, чтобы обеспечить четкие результаты.

3. Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия является очень мощным аналитическим методом, который может идентифицировать посттрансляционные модификации с большой точностью, которые нелегко визуализировать с помощью методов, описанных выше. Ионизирующая масс-спектрометрия работает, разделяя белки или пептиды по массе и заряду, ускоряя их на детекторе и создавая уникальный спектр для каждого белка (или фрагмента белка).

Недостатки использования исключительно масс-спектрометрии для оценки качества белка состоят в том, что метод относительно малопроизводителен и требует сложной подготовки образца. Кроме того, трудно оценить, являются ли белки в образце целыми, так как процесс денатурирует и не выявляет события неправильного фолдинга.

4. Однородность: динамическое рассеяние света

Если ваш белок выглядит чистым на методах, описанных выше, пришло время проверить что он диспергирован в образце (т.е. не агрегирует). Динамическое рассеяние света (DLS – dynamic light scattering) использует поляризованный лазерный луч для измерения уровня дифракции в образце с небольшими молекулами (или в нашем случае с белками). Происходящее рассеяние зависит от гидродинамического радиуса частиц в растворе. Хотя DLS — это простая в использовании методика, которая обеспечивает превосходную качественную информацию, она не дает полной картины распределения размера в образце белка, поскольку агрегаты могут легко перегружать детектор. Этот метод также не подходит для оценки четвертичных структур (то есть димеров по сравнению с мономерами). С учетом вышесказанного удобство DLS в сочетании с его способностью выявлять образование агрегатов во времени делает его широко используемым методом оценки однородности.

5. Микрофлюидная диффузионная калибровка (MDS) (Fluidic Analytics)

Микрофлюидная диффузионная калибровка (MDS), используемая в системе Fluidity One от Fluidic Analytics, — это быстрый и простой способ измерения размера и концентрации белка. В MDS используются микрожидкостные чипы для подачи пробы белка в канал, где он течет вместе со вспомогательной жидкостью в стационарном ламинарном потоке — без перемешивания. Единственный способ, которым белки могут перемещаться из одного потока в другой, — это диффузия, которая происходит со скоростью, пропорциональной их размеру (гидродинамический радиус, R_h ). После некоторой диффузии два потока снова разделяются и белки маркируются. Соотношение рассеянного и нерассеянного используется для расчета R_h.

MDS избегает некоторых подводных камней других технологий. Нет взаимодействия между белком и матрицей, как при электрофорезе, и образцы находятся в своем естественном состоянии. Требуемый рабочий процесс прост, выдача результатов занимает менее 10 минут с использованием образцов с концентрациями до 10 мкг/мл.

Какой метод я должен использовать для анализа моего белка?

Выбор методов измерения количества, чистоты и общего качества образца белка может быть ошеломляющим, но это избавит вас от многих головных болей в будущем. Хотя существует множество методов, вам не нужно выбирать только один — все методы, описанные выше, могут использоваться в тандеме друг с другом, чтобы обеспечить наиболее точную и исчерпывающую картину состояния образцов белка.