Touchdown PCR: советы для начинающих

Когда я впервые услышал о touchdown ПЦР (TD-ПЦР), я подумал о приземляющемся самолете, который, как оказалось, дает неплохую абстракцию данному методу.

Но, несмотря на то, что он поддается аналогиям и ужасным каламбурам, TD-PCR, очень полезный метод для улучшения специфичности амплификации ПЦР, сложнее, чем может показаться на первый взгляд. Поэтому в этой статье я предоставлю учебник по этому методу и несколько советов и рекомендаций по его совершенствованию.

Итак, начнем…

Что такое TD-ПЦР?

TD-PCR представляет собой модификацию PCR, в которой начальная температура отжига выше, чем оптимальная температура плавления  праймеров (Tm), и постепенно снижается в течение последующих циклов до тех пор, пока не будет достигнута температура Tm или «температура приземления», во многом подобно приземлению самолета.

Постепенное понижение температуры до более допустимой температуры отжига в ходе циклирования способствует усилению требуемого ампликона.

Почему TD-PCR работает лучше?

Оптимальная температура отжига является обязательным требованием в ПЦР. Обычно это определяется на основе температуры плавления (Tm) пары праймер-матрица. Но на Tm по-разному влияют отдельные компоненты буфера, даже концентрации праймера и матрицы, поэтому любое вычисленное значение Tm праймера является лишь приблизительным. Поэтому часто бывает трудно найти правильную температуру отжига для данной комбинации праймер / матрица.

Низкие температуры отжига могут привести к образованию праймера-димера и неспецифических продуктов, в то время как слишком высокие температуры уменьшают выход из-за плохого отжига праймера.

При использовании температур, превышающих расчетную Tm в начальных циклах, TD-ПЦР способствует только накоплению ампликонов, комплементарность праймер-шаблон которых является самой высокой. Ступенчатый переход к более низкой температуре во время последующего цикла защищает от более низких выходов за счет использования желаемых ампликонов в реакции, которая теперь превосходит любые неспецифические продукты или димеры праймеров, если они присутствуют.

Каковы условия цикличности TD-ПЦР?

Протокол, опубликованный в Nature Protocols, работает очень хорошо и является хорошей отправной точкой для начала работы с TD-ПЦР.

Предлагаемая программа состоит из двух этапов. На первом этапе  используется Tm, которая приблизительно на 10°C выше расчетного Tm. Температура снижается на 1°C каждый последующий цикл, пока не будет достигнут расчетный диапазон Tm. Это длится в общей сложности 10-15 циклов.

Фаза 2 следует за общим усилением ПЦР до 20-25 циклов с использованием конечной температуры отжига, достигнутой в фазе приземления.

Циклы и перепад температуры во время фазы приземления можно регулировать от 1-3 циклов на падение температуры на 1-3°C, если все еще наблюдаются неспецифические продукты или если выход низкий.

Схема TD-ПЦР
Принципиальная схема touchdown ПЦР

Общие советы по TD-ПЦР:

  1. Хранение всех образцов в холодном состоянии до начала термоциклирования имеет решающее значение для предотвращения неспецифического праймирования даже с помощью TD-ПЦР
  2. Настройка горячего запуска предпочтительна. Поскольку основной целью TD-ПЦР является устранение неспецифических взаимодействий во время начальных циклов, важно использовать настройку горячего запуска.
  3. TD-PCR может решить проблемы с моноплексными реакциями лучше, чем мультиплексные реакции.
  4. Общее количество циклов ПЦР, включая фазу приземления, должно быть низким (ниже 35). Слишком много циклов приведет к появлению неспецифических полос в геле.
  5. Дополнительный 1-минутный цикл денатурации при 96°C или 97°C может быть чрезвычайно полезным для сложных шаблонов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте, как обрабатываются ваши данные комментариев.