Вы можете провести ПЦР менее чем за 30 минут? Если нет, попробуйте «быструю ПЦР» (Fast PCR) — термин, придуманный для обозначения стандартного протокола ПЦР, который проводится с более быстрым изменением температуры, более быстрыми ферментами и сокращением или объединением шагов в ходе реакции.
Но скорость полимеразной цепной реакции нельзя увеличить просто так. Самая большая проблема в быстрой ПЦР — ускорение реакции без ущерба для точности. Чтобы получить надежные и последовательные результаты в быстрых экспериментах по ПЦР, крайне важно, чтобы каждый из различных компонентов системы был оптимизирован, чтобы избежать изменчивости скорости реакции ПЦР от эксперимента к эксперименту. Разные компоненты системы ПЦР, такие как скорость нагрева и однородность блоков, тепловой перенос через реакционный сосуд и скорость полимеразы, должны быть оптимизированы одновременно. Поэтому будущее за системами ПЦР, в которых все элементы разработаны для максимальной совместимости.
Быстрые ферменты
ДНК-полимеразы Kapa Biosystems разрабатываются с использованием процесса молекулярной эволюции. Наборы KAPA SYBR® FAST qPCR содержат полимеразу, которая значительно меньше ингибируется красителем SYBR® Green, демонстрируя очень высокое сродство к ДНК. В результате, комплекты KAPA SYBR® FAST qPCR способны достигать самых быстрых результатов, сохраняя при этом высокую эффективность реакции и чувствительность. Обычно, в наборах друхи производителей увеличивают концентрацию полимеразы Taq дикого типа, чтобы увеличить скорость ПЦР, что может привести к снижению эффективности реакции.
Недавно Kapa Biosystems выпустила быстрые комплекты ПЦР на основе их спроектированной ферментной технологии, включая KAPA2G Fast HotStart, KAPA2G Robust HotStart, KAPA SYBR® FAST qPCR Kits и KAPAHiFi HotStart DNA Polymerase. Все эти полимеразы являются высокопроцессными и способны продлить время в 1 сек/кб без потери производительности.
Инженерные ферменты также производит компания Finnzymes Instruments (Бренд Thermo Fisher Scientific). Скорость и надежность их ДНК-полимераз Phusion и Phire основаны на нескольких особенностях. Во-первых, они очень процессуальные. Во-вторых, они используют более высокие температуры денатурации и отжига, что позволяет сократить время удержания и обеспечить более простой двухэтапный протокол. Три варианта полимераз, основанных на горячем старте, основаны на уникальной технологии, позволяющей реактивировать нулевое время. Недавно разработанные полимеразы, которые лучше имитируют комплексы биологической репликации (и, следовательно, обладают большей технологичностью и устойчивостью к ингибиторам), являются захватывающей разработкой для быстрой ПЦР. Благодаря этому сокращается не только время проведения самой ПЦР, но также и при подготовке проб, поскольку ПЦР можно проводить непосредственно из различных тканей без очистки или экстракции ДНК. Прямая ПЦР возможна с полимеразами Phusion и Phire DNA, потому что эти надежные ферменты исключительно устойчивы ко многим ингибиторам ПЦР, присутствующим в неочищенных образцах, и также способны выдерживать более высокие температуры, используемые в прямых протоколах.
Быстрые инструменты
Узким местом, накладывающим ограничения на скорость ПЦР является процесс передача тепла между блоком и реакционной смесью. Чем тоньше стенки пробирки или планшета, тем быстрее происходит передача тепла и, следовательно, сама реакция. Ультратонкие реакционные сосуды изготавливаются с использованием нового способа полимеризации для литьевого формования. Такие сосуды имеют стенки толщиной менее 150 мкм, что в два раза меньше толщины обычных тонкостенных пробирок и планшетов для ПЦР. Задача быстрой ПЦР заключается в поддержании однородной температуры всех образцов внутри блока. Некоторые производители предлагают термоциклеры с высокой скоростью нагрева, однако при этом жертвуют однородностью температуры в термоблоке.
Буферы и наборы
Новые буферы или смеси (master-mix) могут также ускорить работу ПЦР. Например, набор для быстрой ПЦР PCC Kit от QIAGEN — это основная смесь, которая включает в себя новую молекулу с Q-связтю, которая облегчает быстрое термоциклирование и их полимеразу HotStarTaq Plus. Комбинация основной смеси полимеразы и буферной системы PCR предоставляет исследователям протокол, который практически не требует оптимизации. ПЦР с быстрым SNP-зондом для генотипирования SNP (одиночный нуклеотидный полиморфизм) имеет уникальную буферную систему ПЦР, которая поддается более узким пикам плавления, что приводит к более высокой аллелической дискриминации, более высоким уровням звонков и меньшей ошибкой. Комбинация полимеразы, системы буферизации и Q-решения предоставляет исследователям предварительно оптимизированный протокол, совместимый со стандартными ПЦР, стандартными скоростными ПЦР и ПЦР в реальном времени. Полная процедура занимает на 40% меньше времени, чем другие системы генотипирования SNP на основе зондов.
Слияние высокоэффективных реагентов с высокоскоростным оборудованием — это растущая тенденция, которая ускорит темпы развития геномики, генетического тестирования и молекулярной диагностики.
Добавить комментарий